FUNDAMENTO: O papel do estresse oxidativo em pacientes idosos hipertensos com síndrome de apneia-hipopneia obstrutiva do sono (SAHOS) é desconhecido. Objetivo: O objetivo foi avaliar os níveis de Big Endotelina-1 (Big ET-1) e Óxido Nítrico (NO) em pacientes idosos hipertensos com e sem SAHOS moderada a grave. MÉTODOS: Os voluntários permaneceram internados durante 24 horas. Obtivemos os seguintes dados: índice de massa corporal (IMC), Monitorização Ambulatorial da Pressão Arterial (MAPA) - 24 horas, e medicação atual. Sangue arterial foi coletado às 7:00 h e às 19:00 h para determinar níveis plasmáticos de NO e Big ET-1. A oximetria de pulso foi realizada durante o sono. A correlação de Pearson, Spearman e análise de variância univariada foram utilizadas para a análise estatística. RESULTADOS: Foram estudados 25 sujeitos com SAHOS (grupo 1) e 12 sem SAHOS (grupo 2), com idades de 67,0 ± 6,5 anos, 67,8 ± 6,8 anos, respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos em IMC; no número de horas de sono; PA diastólica e sistólica em 24 h; PA de vigília; PA no sono; ou medicamentos usados para controlar a PA. Não foram detectadas diferenças nos níveis de NO e Big ET-1 plasmáticos às 19:00 h, mas às 7:00 h os níveis de de Big ET-1 foram mais altos (p = 0,03). No grupo 1, correlação negativa também foi observada entre a saturação de oxihemoglobina arterial média e a PA sistólica - 24 horas (p = 0,03, r = -0,44), e Big ET-1 (p = 0,04, r = 0,41). CONCLUSÕES: Na comparação entre idosos hipertensos com e sem SAHOS com PA e IMC semelhantes, observou-se níveis mais elevados de Big ET-1 após o sono no grupo SAHOS. Os níveis de NO não diferiram entre os pacientes hipertensos com ou sem SAHOS.
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP - Brasil
O endotélio desempenha um papel fundamental na regulação do tônus vascular e resistência periférica, através da síntese de vários compostos vasoativos, ou seja, vasodilatadores, tais como Óxido Nítrico (NO) e vasoconstritores tais como Big endotelina-1 (Big ET-1), por células endoteliais1-3. Sob condições patológicas, tal como hipertensão arterial sistêmica, existe um desequilíbrio de fatores derivados do endotélio, com uma atenuação de vasodilatadores e uma predominância de vasoconstritores4. A taxa de eliminação da endotelina-1 (ET-1) é maior do que a de seu precursor Big ET-1. Além disso, os níveis de Big ET-1 plasmáticos de seres humanos, coelhos, e ratos são maiores do que os níveis de ET-1 plasmático, com estudos sugerindo que o precursor é um indicador mais apropriado para a quantificação da liberação por células endoteliais5.
O óxido nítrico tem uma influência importante sobre o tônus dos vasos sanguíneos periféricos, e é liberado em resposta ao estresse de cisalhamento produzido pelo fluxo de sangue e pela ativação de vários receptores6. Como o NO é liberado continuamente, a inibição sistêmica da sua síntese provoca uma elevação da pressão arterial (PA). Nesta base, o estresse oxidativo desempenha um papel importante na patogênese da hipertensão7.
Também considera-se que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese da hipertensão arterial na síndrome de apneia-hipopneia obstrutiva do sono (SAHOS)8. A SAHOS é definida como um grupo de desordens caracterizado por cessação periódica da respiração, consequentemente causando hipóxia e uma frequente fragmentação do sono durante a noite, causando sonolência excessiva durante o dia9. Esta síndrome é mais prevalente entre os idosos10. De acordo com o índice de apneia e hipopneia (IAH/h), a SAHOS é classificada como leve (IAH/h, 5-15 eventos/h), moderada (IAH/h, 15-30 eventos/h) e grave (IAH/h, > 30 eventos/h)11. Além disso, a mortalidade está significativamente associada com altas taxas de alterações respiratórias [despertares e microdespertares durante o sono]; um índice de massa corporal (IMC) de >30 kg/m2, e com o sexo masculino12.
Poucos estudos avaliaram a função endotelial na SAHOS, e o papel do estresse oxidativo em idosos hipertensos com SAHOS é desconhecido. O objetivo do presente estudo foi avaliar Big ET-1 e NO antes e depois do sono em idosos hipertensos com e sem SAHOS.
Os pacientes hipertensos foram selecionados nos seguintes ambulatórios: Ambulatório de Hipertensão do Hospital das Clínicas, Ambulatório de Geriatria do Centro Saúde Escola e no Núcleo de Saúde da Família V, todos pertencente à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Todos os voluntários hipertensos com SAHOS moderada a grave tinham diagnóstico prévio confirmado pela polissonografia. Os pacientes hipertensos do grupo controle foram submetidos à polissonografia para excluir a SAHOS. Os pacientes hipertensos diagnosticados com SAHOS moderada ou grave foram diagnosticados pelo Laboratório de Neurofisiologia Clínica (Hospital das Clínicas - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto) e selecionados seguindo os critérios de exclusão descritos abaixo.
Os critérios de exclusão foram baseados nos seguintes fatores que podem afetar a avaliação dos níveis plasmáticos de Big ET-1 e NO: idade < 60 anos, diabetes melitus, dislipidemia, doenças cardíacas e pulmonares, tabagismo, histórico de tabagismo, etilismo, uso de ventilação com pressão positiva contínua nas vias aéreas, arritmia cardíaca e uso de medicamentos que possam interferir no sono (ansiolíticos, antidepressivos e neurolépticos). Pacientes que não concordaram em participar também foram excluídos.
Os voluntários foram internados na Unidade de Pesquisa Clínica do HCFMRP-USP. Na admissão, o peso e a altura eram medidos utilizando-se uma balança digital (Filizola) e o monitor de monitorização ambulatorial da pressão arterial (MAPA) era instalado (SpaceLabs 90207, Redmond, EUA). O aparelho permanecia durante 24 horas, sendo divididas em período provável de vigília (7:00 a 23:00 h) e período provável de sono (23:00 a 07:00 h). O aparelho foi programado para fazer leituras em intervalos de 15 minutos durante o período de vigília e em intervalos de 20 minutos durante o período de sono. Além disso, antes de cada coleta de sangue para dosagem da Big ET-1 e NO plasmático, foram realizadas três medidas da PA com aparelho de coluna de mercúrio (método auscultatório), no membro superior contralateral ao utilizado para o manguito da MAPA, com o paciente na posição sentada.
Uma amostra de sangue arterial de 4,5 ml foi coletada às 19:00 h no dia da admissão e às 7:00 h da manhã seguinte para a determinação dos níveis de NO plasmático (µM). Cada amostra foi dividida em três alíquotas, e 1,5 ml de sangue arterial foi armazenado em um tubo Eppendorf contendo 0,08 ml de heparina e centrifugado (Eppendorf AG, modelo 5418R) durante 10 min a 5000 rpm e uma temperatura padrão de 4&ºC. O sobrenadante (300 µl) de cada tubo Eppendorf foi removido e transferido para um novo tubo, que foi armazenado em um congelador a -70&ºC para determinação posterior por quimioluminescência (especificidade de 93,9%). Cada amostra de sangue arterial também foi processada para determinar os níveis plasmáticos de Big ET-1 (pg/ml). A amostra coletada foi imediatamente dividida em três alíquotas em tubos Eppendorf. Cada tubo continha 0,1 ml EDTA/1,5 ml de sangue e 0,1 ml aprotinina/1,5 ml de sangue em cada. Para atingir este valor, 0,39 mg de EDTA foi diluída em 350 ml de solução salina a 0,9% e 0,39 mg de aprotinina foi diluída em 350 ml de solução salina a 0,9%. A amostra foi então centrifugada no mesmo aparelho que o utilizado para a amostra utilizada para a quantificação dos níveis de NO durante 15 minutos, mas a 1600 rpm e a uma temperatura de 0&ºC. O sobrenadante (300 ml) de cada tubo Eppendorf foi removido e transferido para um novo tubo, que foi armazenado em um congelador a -70&ºC para determinação posterior por ELISA (sensibilidade de 0,30 pg/ml e especificidade de 100%). A sensibilidade para este kit foi determinada de acordo com as orientações da Comissão Nacional de Normas Clínicas de Laboratório (NCCLS) em seus Protocolos de Avaliação. (National Committee for Clinical Laboratory Standards Evaluation Protocols, SC1, (1989) Villanova, PA, EUA: NCCLS).
Oximetria de pulso (Dixtal, modelo DX 2022) foi registrada em todos os voluntários das 21:00 h às 07:00 h. Um sensor de dedo colocado no dedo indicador contralateral ao braço usado para medição da PA usando o dispositivo de MAPA foi usado para determinar o nível de saturação arterial de oxihemoglobina (saturação de O2).
O estudo de polissonografia foi realizado no Laboratório de Neurofisiologia Clínica do HCFMRP-USP usando o polígrafo Biologic Sleepscan Vision PSG (NatusBiologic Systems, San Carlos, CA, EUA) para obter o IAH/h, tal como descrito anteriormente, o número total de episódios de apneia e hipopneia (NAH) durante o sono, e o número de NDM.
A média e o desvio-padrão foram calculados para os dados com uma distribuição normal (paramétrica), e a mediana foi calculada para dados não-paramétricos (aqueles sobre Big ET-1 e NO). O software SAS ® 9.0 foi usado para a análise estatística. O teste exato de Fisher foi usado para descrever as frequências de acordo com o gênero. Para determinar possíveis correlações entre as variáveis, o coeficiente de correlação de Pearson foi calculado para dados paramétricos e o coeficiente de correlação de Spearman foi calculado para os dados não paramétricos utilizando o software R. Na análise de Big ET-1 e NO, a correção foi feita para variáveis PA, IMC e NAH porque essas variáveis podem influenciar o resultado final (análise de variância univariada).
O estudo foi submetido ao Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e aprovado de acordo com o número de protocolo 14103. Todos os participantes receberam informações detalhadas sobre os objetivos e procedimentos do estudo e assinaram um termo de consentimento em conformidade com a Resolução 196/96 do Conselho Nacional da Saúde.
A
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Avaliação das medidas da PA obtidas para os voluntários como um todo revelou uma boa correlação estatística entre as medidas obtidas por ausculta e 24 h MAPA (PAS:. p < 0,001, R = 0,68; PAD: p < 0,001, R = 0,61).
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Níveis de NO plasmático determinados às 19:00 h e 07:00 h (
Quando o grupo 1 e o grupo 2 foram analisados em conjunto, não foram encontradas correlações entre a pressão arterial e várias variáveis, incluindo Big ET-1, NO, saturação de O2, IAH e NDM. No entanto, foi observada uma correlação entre o IMC e o nível de saturação de O2 média (r = -0,43, p = 0,008) e entre o IMC ea NDM (r = 0,51, p = 0,002) (
Considerando-se apenas o grupo com SAHOS, verificamos correlações significativas entre PAS (método auscultatório) e Big ET-1 (r = 0,42, p = 0,04); PAS (MAPA) 24 horas e saturação de O2 média (r = -0,44 p = 0,03); e 24-h PAD e NDM (r = 0,50 p = 0,01). Os níveis de saturação de O2 foram negativamente correlacionados com Big ET-1 (r = 0,41, p = 0,04).
Considerando-se apenas o grupo sem SAHOS, observou-se que a PAS durante o sono obtida pela MAPA correlacionou-se com o NAH (r = 0,71 p = 0,01) e com o IAH (r = 0,67, p = 0,02). Correlação inversa foi observada entre o nível de saturação de O2 e o NDM (r = -0,61, p = 0,05) e o nível de saturação O2 e o IMC (r = -0,58, p = 0,05).
Atualmente, as alterações do sono são altamente prevalentes na população em geral, em especial os idosos. Estudos epidemiológicos têm apontado que a elevação da PA está associada a distúrbios do sono13,14 devido ao alto IAH9, resultando em sonolência excessiva diurna e alterações cardiorrespiratórias14. Além disso, Ip e cols.8 indicaram que a elevação da pressão arterial ocorre no final de cada episódio de apneia obstrutiva.
Avaliando a PA com a MAPA, não observamos diferenças entre a PAS e PAD nos indivíduos com e sem SAHOS, durante o período de 24 horas, incluindo períodos de sono e vigília. Este achado difere do observado por Martinez Garcia e cols.9, que observaram maior PAS e PAD em pacientes com SAHOS, mas corrobora com Davies e cols.15, que não encontraram diferença na PAS de vigília e 24h entre os grupos com e sem SAHOS, e também com um estudo citado por Davies e cols. 15, o qual, comparando a PAS e PAD nos mesmos grupos, não encontrou diferenças na PA durante o sono e a vigília.
Em nosso estudo, a redução da PA durante o período de sono foi semelhante entre os grupos com e sem SAHOS, e ambos os grupos mostraram uma atenuação da queda da pressão arterial, com valores < 10%. É importante ressaltar que ambos os grupos são hipertensos controlados em uso contínuo de medicações antihipertensivas, não havendo diferenças entre o número de medicamentos em ambos os grupos.
No entanto, o número pequeno de voluntários pode ter limitado o poder para detectar diferenças na PA entre os grupos.
O resultado da medição convencional da PA realizada às 19:00 h e 07:00 h pela ausculta por um pesquisador treinado correlaciounou-se bem com a PA por MAPA 24 h. Isto sugere que, mediante a dispponibilidade das habilidades necessárias, a ausculta pode ser utilizada na prática clínica quando MAPA não está prontamente disponível, ou, por vezes, quando é necessária a reavaliação periódica. No entanto, é importante notar que MAPA é o padrão ouro para avaliação de PA16 e que a obtenção de dados desta forma permitiu o estudo ser conduzido durante o sono e a vigília.
Um ponto importante a ser observado neste estudo foi a diferença encontrada com relação à saturação de O2 mínima e média durante o sono, onde o grupo com SAHOS, conforme já era esperado, apresentou hipoxemia significativa. Lima e cols.17 observaram o mesmo efeito de hipóxia em pacientes com apneia do sono comparado a indivíduos saudáveis, e dados semelhantes foram obtidos por Peled e cols.12.
Ao avaliarmos os eventos respiratórios através da polissonografia, verificamos que em relação ao NDM, NAH e IAH, existiam diferenças significativas entre os grupos, o que concorda com trabalhos publicados, já que são dados relevantes na caracterização dos indivíduos. Estes achados estão de acordo com os relatados por Lima e cols.17 e Ventura e cols.18
Está bem definida a importância clínica do NO sobre os efeitos da pressão arterial, uma vez que este poderoso vasodilatador influencia diretamente o tônus dos vasos sanguíneos periféricos e a sua inibição gera HAS7. Sabe-se que a atividade basal de NO é reduzida em pacientes hipertensos. Ip e cols.8 afirmaram que NO endotelial também pode desempenhar um papel importante na regulação da pressão arterial em indivíduos com SAHOS19.
Porém, há relatos na literatura que a deficiência do NO em indivíduos portadores da HAS pode ser revertida através da administração de medicamentos antihipertensivos3,20. Um estudo realizado em camundongos hipertensos evidenciou que, após o uso de captopril, não ocorreu inibição da síntese do NO e, consequentemente, houve regulação da PA. Outro medicamento antihipertensivo que ocasionou atenuação da PA e melhora da vasodilatação mediada pelo NO, foi a espironolactona 20
Em nosso estudo, conforme relatado anteriormente, os níveis basais do NO não diferiram entre os indivíduos hipertensos com e sem SAHOS. Um ponto a ser observado é que ambos os grupos são compostos por hipertensos controlados com medicamentos antihipertensivos, não havendo diferenças entre os grupos com relação aos níveis de PA. Baseado nestes dados pode-se supor que em casos de HAS controlada, a atividade do NO encontra-se equilibrada.
Estudos realizados em idosos têm demonstrado um aumento nos níveis plasmáticos de ET-1 em comparação com indivíduos jovens4. Zamarron Sanz e cols.21 confirmaram um aumento significativo nos níveis de ET-1 em indivíduos com SAHOS, em comparação com indivíduos saudáveis. Jordan e cols.22 encontraram uma elevação da concentração plasmática da Big ET-1 no grupo com SAHOS sem tratamento clínico ou cirúrgico. No presente estudo, os níveis mais elevados de Big ET-1 foram observados em indivíduos com SAHOS após o sono às 7:00 h.
De uma maneira geral, os níveis de ET-1 plasmática tendem a ser baixos, contudo não foi estabelecido um consenso a respeito de protocolos definitivos que permitam a determinação reprodutível dos níveis da ET-1 e Big ET-1 em diferentes fluídos biológicos. Há muitas variações em protocolos de extração sobre os valores basais, variando entre 0,5 e 50 pg/ml, tornando-os, muitas vezes, difíceis de comparar23. No presente estudo, as dosagens da Big ET-1 apresentaram grande variabilidade, mesmo utilizando técnicas de processamento e armazenamento idênticas.
Quando avaliamos as variáveis no grupo com SAHOS, encontramos correlações negativas entre a PAS e a média da saturação de O2, ou seja, à medida que diminuiu a oxigenação arterial ocorreu uma elevação da PAS.
Além disso, observamos que o aumento da concentração da Big ET-1 estava correlacionado à maior dessaturação e a PAS foi positivamente correlacionada com os níveis de Big ET-1; portanto, quanto maior a vasoconstrição causada pela Big ET-1, maior a PAS. Além disso, observou-se uma correlação positiva entre NAH, IAH, e os níveis plasmáticos de Big ET-1, sugerindo um possível aumento da vasoconstrição associada com episódios crescentes de NAH. Por menor que seja o número de despertares em indivíduos portadores da síndrome, ocorrerá um aumento do tônus simpático com grande elevação, não somente da PA, como também da frequência cardíaca. Dependendo da intensidade da apneia do sono, este processo pode ocorrer centenas de vezes durante a noite24.
Portanto, o NDM durante o sono contribui para a hiperatividade autonômica, sendo um dos mecanismos que explicam a HAS ocasionada a SAHOS25.. No presente estudo, foi observada uma correlação positiva entre a NDM e PAD (durante o sono, vigília, e em 24 h da MAPA), com o aumento da PAD sendo relacionada com a maior fragmentação do sono, durante o tempo total de sono. Não foi observada uma correlação significativa entre NDM e PAS (p > 0,05). Martinez-Garcia e cols.9 encontraram uma correlação mais significativa entre NDM e PAD (durante o sono e a vigília). Em contrapartida, Logan e cols.26 observaram uma maior correlação entre a fragmentação do sono e PAS.
Correlacionamos também o IMC vs NDM e observamos que maior índice de massa corpórea associou-se com o aumento do NDM, podendo-se supor que interfira na qualidade do sono dos indivíduos com apnéia do sono. De acordo com Ware, McBrayer e Scott27 os eventos de apnéia são altamente sensíveis às mudanças do IMC, ou seja, quanto maior o peso, maior a probabilidade de aumentar a frequência de apnéia.
Conforme descrito anteriormente, a obesidade é um importante fator patogênico da SAHOS14.
Aproximadamente 70% dos indivíduos com diagnóstico de apneia do sono são considerados obesos de acordo com IMC, sendo este o único fator de risco significativo que é reversível10.
No presente estudo, observamos no grupo sem SAHOS que o aumento no NAH estava correlacionado com a elevação da PA sistólica durante o sono. Grote e cols.28 ao estudarem a influência do IAH na pressão arterial, observaram que a probabilidade de hipertensão não controlada aumenta em 2% a cada aumento unitário do IAH.
No idoso, ocorre um aumento progressivo no número de microdespertares durante o sono, sendo uma característica do envelhecimento devido uma redução na ação da musculatura das vias aéreas. Antczak e cols. 29 relataram que existem evidências de que a obesidade, mesmo na ausência de distúrbios respiratórios do sono, afeta negativamente a qualidade do sono, aumentando a sonolência diurna.
Além disso, estudos têm observado que pacientes obesos sem SAHOS apresentaram uma maior frequência de despertares durante o sono, comparados a pacientes de peso normal30,31. Neste contexto, acredita-se que, independentemente de um indivíduo ter SAHOS ou não, a obesidade é um fator extremamente importante para a qualidade do sono. No presente estudo, os grupos não diferiram em termos de prevalência de obesidade.
Além disso, observou-se que a obesidade influencia negativamente os níveis de saturação de O2, com o aumento do IMC causando maior dessaturação. Ao correlacionar NDM com níveis de saturação de O2, observou-se um declínio na saturação com a maior fragmentação do sono.
Em conclusão, idosos hipertensos com SAHOS apresentaram níveis mais elevados de Big-ET-1 após o sono, independentemente da pressão arterial, uma vez que suas pressões arteriais eram controladas e semelhantes às PAS dos pacientes idosos hipertensos sem SAHOS.Em pacientes com SAHOS, foi observada uma correlação entre Big ET-1 e PAS; Big ET-1 e NAH, e a saturação de O2 e PAS. Em ambos os grupos, um IMC mais elevado foi correlacionado com maior dessaturação e NDM. Os níveis de ON não diferiram entre os pacientes hipertensos com ou sem SAHOS. Vale ressaltar que ambos os grupos consistiram em pacientes hipertensos controlados com medicamentos anti-hipertensivos.
Concepção e desenho da pesquisa: Anunciato IF, Lima NKC; Obtenção de dados: Anunciato IF, Lobo RR, Verri Jr. WA, Eckeli AL, Évora PRB, Nobre F; Análise e interpretação dos dados: Anunciato IF, Lobo RR, Eckeli AL, Lima NKC; Análise estatística: Coelho EB, Lima NKC; Obtenção de financiamento: Lima NKC; Redação do manuscrito: Anunciato IF, Moriguti JC, Ferriolli E, Lima NKC; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Anunciato IF, Coelho EB, Verri Jr. WA, Évora PRB, Nobre F, Moriguti JC, Ferriolli E, Lima NKC.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAEPA.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Iara Felício Anunciato pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.
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Iara Felicio Anunciato Rua Natalicia Frederico de Vicenti, 30, JD Maria Imaculada I CEP 14340-000, Brodowski, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 11/10/12; revisado em 29/11/12; aceito em 15/03/13.
BACKGROUND: The role of oxidative stress in hypertensive elderly patients with obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS) is unknown. OBJECTIVE: The purpose was to evaluate the levels of big endothelin-1 (Big ET-1) and nitric oxide (NO) in elderly hypertensive patients with and without moderate to severe OSAHS. METHODS: Volunteers were hospitalized for 24 h. We obtained the following data: body mass index (BMI); 24-ambulatory blood pressure monitoring; and current medication. Arterial blood was collected at 7pm and 7am for determining plasma NO and Big ET-1 levels. Pulse oximetry was performed during sleep. Pearson's or Spearman's correlation and univariate analysis of variance were used for statistical analysis. RESULTS: We studied 25 subjects with OSAHS (group 1) and 12 without OSAHS (group 2) aged 67.0 ± 6.5 years and 67.8±6.8 years, respectively. No significant differences were observed between the groups in BMI; number of hours of sleep; 24-h systolic and diastolic BPs; awake BP, sleep BP and medications to control BP between groups. No differences were detected in plasma Big ET-1 and NO levels at 19:00 h, but plasma Big ET-1 levels at 7:00 h were higher in group 1 (p =0.03). In group 1, a negative correlation was also observed between the mean arterial oxyhemoglobin saturation level, 24-h systolic BP (p = 0.03, r = -0.44), and Big ET-1 (p = 0.04, r = -0.41). CONCLUSIONS: On comparing elderly hypertensive patients with and without OSAHS having similar BP and BMI, we observed higher Big ET-1 levels After sleep in the OSAHS group. NO levels did not differ between the hypertensive patients with or without OSAHS.
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP - Brasil
The endothelium plays a fundamental role in the regulation of vascular tone and peripheral resistance through the synthesis of numerous vasoactive compounds, i.e., vasodilators such as nitric oxide (NO) and vasoconstrictors such as big endothelin-1 (Big ET-1), by endothelial cells1-3. Under pathological conditions such as systemic arterial hypertension, there is a disequilibrium of endothelium-derived factors with an attenuation of vasodilators and a predominance of vasoconstrictors4. The elimination rate of endothelin-1 (ET-1) is higher than that of its precursor Big ET-1. In addition, plasma Big ET-1 levels of humans, rabbits, and rats are higher than plasma ET-1 levels, with studies suggesting that the precursor is a more appropriate indicator for the quantification of release by endothelial cells5.
NO has an important influence on the tone of peripheral blood vessels, and it is released in response to the shear stress produced by blood flow and by the activation of various of receptors6. Because NO is released continuously, systemic inhibition of its synthesis causes an elevation of blood pressure (BP). On this basis, oxidative stress plays an important role in hypertension pathogenesis7.
Oxidative stress is also considered to be involved in the pathogenesis of arterial hypertension in obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS)8. OSAHS is defined as a group of disorders characterized by periodic cessation of breathing, with consequent hypoxia, frequent awakenings, and sleep fragmentation during the night, triggering excessive daytime somnolence9. This syndrome is more prevalent among the elderly10. According to the apnea-hypopnea index (AHI/h), OSAHS is classified as mild (AHI/h, 5-15 events/h); moderate (AHI/h, 15- 30 events/h); and severe (AHI/h, > 30 events/h) 11. Furthermore, mortality is significantly associated with high rates of respiratory changes [awakenings and microawakenings during sleep]; a body mass index (BMI) of >30 kg/m2; and male sex12.
Few studies have assessed endothelial function in OSAHS, and the role of oxidative stress in elderly hypertensive patients with OSAHS is unknown. The objective of the present study was to evaluate Big ET-1 and NO before and after sleep in elderly hypertensive patients with and without OSAHS.
The hypertensive patients were selected from the outpatient services of the following centers of the Ribeirao Preto School of Medicine, São Paulo University: the Hypertension Center of the Clinical Hospital; the Geriatric Clinic of the School Health Center; and the Center for Family Health -V. All hypertensive volunteers with moderate to severe OSAHS had previous diagnoses confirmed by polysomnography; control hypertensive subjects were also subjected to further examination to exclude OSAHS. The hypertensive patients diagnosed with moderate or severe OSAHS were diagnosed by the Laboratory of Clinical Neurophysiology (Clinical Hospital - Ribeirao Preto School of Medicine) and selected following the exclusion criteria described below.
Exclusion criteria were based on the following factors that could affect the evaluation of plasma Big ET-1 and NO levels: age <60 years, diabetes mellitus, dyslipidemia, heart and lung diseases, smoking, past history of smoking, drinking, use of continuous positive pressure airway ventilation, cardiac arrhythmia, and use of medications that might interfere with sleep (anxiolytics, antidepressants, and neuroleptics). Patients who did not consent to participate were also excluded.
The volunteers were admitted to the Clinical Research Unit of HCFMRP-USP. Upon admission, weight and height were measured using a digital scale (Filizola), and the device for the ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) was installed (SAPCELABS 90207, Redmond, USA. The ABPM device was left in place for 24 h, divided into a probable wakefulness period (7:00-23:00 h) and a probable sleep period (23:00-7:00 h). The device was programmed to take readings at 15 minute intervals during the probable wakefulness period and at 20 minute intervals during the probable sleep period. Before each blood collection for the determination of Big ET-1 and plasma NO, three BP measurements were made with the subject in the sitting position, using a mercury column device (auscultatory method) on the upper limb contralateral to that wearing the cuff for ABPM.
A 4.5-ml arterial blood sample was collected at 19:00 h on the day of admission and 7:00 h the following morning for the determination of plasma NO levels (µM). Each sample was divided into three aliquots, and 1.5 ml arterial blood was stored in an Eppendorf tube containing 0.08 ml heparin and centrifuged (Eppendorf AG, model 5418R) for 10 min at 5000 rpm and a standard temperature of 4&ºC. The supernatant (300 µl) of each Eppendorf tube was removed and transferred to a new tube, which was stored in a freezer at -70&ºC for later determination by chemiluminescence (specificity of 93.9%). Each arterial blood sample was also processed for the determination of plasma Big ET-1 levels (pg/ml). The collected sample was immediately divided into three aliquots in Eppendorf tubes. Each tube contained 0.1 ml EDTA/1.5 ml blood and 0.1 ml aprotinin/1.5 ml blood each. To reach this value, 0.39 mg EDTA was diluted in 350 ml 0.9% saline solution and 0.39 mg aprotinin was diluted in 350 ml 0.9% saline solution. The sample was then centrifuged in the same apparatus as that used for the sample used for quantifying NO levels for 15 min but at 1600 rpm and a temperature of 0&ºC. The supernatant (300 ml) of each Eppendorf tube was then removed, transferred to a new tube, and stored in a freezer at -70&ºC for later determination by ELISA (sensitivity of 0.30 pg/ml and specificity of 100%). The sensitivity for this kit was determined using the guidelines provided by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Evaluation Protocols. (National Committee for Clinical Laboratory Standards Evaluation Protocols, SC1, (1989) Villanova, PA, USA: NCCLS).
Pulse oximetry (DIXTAL, model DX 2022) was recorded from 7pm to 7am for all volunteers. A finger sensor placed on the index finger contralateral to the arm used for BP measurement by ABPM device was used in order to obtain the level of arterial oxyhemoglobin saturation (O2 Sat).
The polysomnography study was performed in the Clinical Neurophysiology Laboratory of HCFMRP-USP using the Biologic Sleepscan Vision PSG Polygraph (NatusBiologic Systems, San Carlos, CA, USA) to obtain the AHI/h, as previously described, the total number of apnea and hypopnea (NAH) episodes during sleep, and the number of NAM.
The mean and standard deviation was calculated for data with a normal distribution (parametric), and the median was calculated for non-parametric data (those regarding Big ET-1 and NO). The SAS®9.0 software was used for these analyses. Fisher's exact test was used to describe the frequencies according to gender. To determine possible correlations between the variables, Pearson's correlation coefficient was calculated for parametric data and Spearman's correlation coefficient was calculated for non-parametric data using R software. For the study of Big ET-1 and NO, we corrected group comparison including BP, BMI and NAH in the analysis since these are factors that may influence the final result (univariate analysis of variance).The study was submitted to the Ribeirao Preto School of Medicine's Ethics Committee and approved in accordance with protocol number 14103. All participants received detailed information about the goals and procedures of the study, and they signed an informed consent form in compliance with Resolution 196/96 of the National Health Council.
Evaluation of the BP measurements obtained for the volunteers as a whole revealed a good statistical correlation between the measurements obtained by auscultation and 24-h ABPM (SBP: p < 0.001, r = 0.68; DBP: p < 0.001, r = 0.61).
Plasma NO levels determined at 19:00 h and 7:00 h (
When group 1 and group 2 were analyzed jointly, no correlations were found between BP and several variables, including Big ET-1, NO, O2 saturation, AHI, and NAM. However, a correlation was observed between BMI and the mean O2 saturation level (r = -0.43, p = 0.008) and between BMI and NAM (r = 0.51, p = 0.002) (
Considering only the group with OSAHS, we detected significant correlations between
The O2 saturation levels were negatively correlated with Big ET-1 (r = -0.41, p = 0.04).
Considering only the group without OSAHS, we observed that sleep SBP recorded by ABPM was correlated with NAH (r = 0.71 p = 0.01) and AHI (r = 0.67, p = 0.02). Inverse correlation was observed between the O2 saturation level and NAM (r = -0.61, p = 0.05) and the O2 saturation level and BMI (r = -0.58, p = 0.05).
Today, sleep changes are highly prevalent in the general population, in particular the elderly. Epidemiological studies have pointed out that BP elevation is associated with sleep disorders13,14 due to the high AHI9, resulting in daytime hypersomnolence and cardiorespiratory changes14. Furthermore, Mary et al8 stated that BP elevation occurs at the end of each episode of obstructive apnea.
When evaluating BP by means of ABPM, we did not observe differences in systolic (S) BP or diastolic (D) BP between subjects with and without OSAHS during sleep, wakefulness and during a 24-hour period. This result differs from that reported by Martinez Garcia et al.9 who observed higher SBP and DBP in patients with OSAHS, but agrees with the report of Davies et al.15 who did not detect a difference in wakefulness or 24-hour SBP between groups with and without OSAHS, and also with an Oxford study cited by Davies et al.15 which, when comparing SBP and DBP between the same groups, did not detect a difference during sleep or wakefulness. In our study, the BP decrease during the sleep period was the same between the groups with and without OSAHS, and both groups showed an attenuation of the decline in BP, with values <10%. It is important to point out that the two groups studied were composed of controlled hypertensive subjects continuously taking antihypertensive medications, with no differences in the number of medications taken. However, the small number of volunteers may have limited the power for detecting differences in BP between the groups.
The result of conventional BP measurement performed at 19:00 h and 7:00 h by auscultatory method by a trained investigator correlated well with the 24-h BP obtained by ABPM. This suggests that where skills exist, auscultatory method can be used in clinical practice when ABPM is not readily available, or at times when periodic reevaluation is necessary. However, it is important to note that ABPM is the gold standard for BP evaluation16, and that obtaining data in this manner allowed the study to take be conducted during sleep and wakefulness.
An important result of the present study was the difference in minimum and mean O2 saturation levels observed during sleep, with the OSAHS group showing significant hypoxemia, as expected. Lima et al17 observed the same hypoxic effect in patients with sleep apnea compared to healthy individuals, and similar data were obtained by Peled et al12.
When we evaluated the respiratory events by polysomnography we observed significant differences between groups regarding NAM, NAH and AHI, in agreement with published reports, since these are relevant data for the characterization of individuals. These data agree with those reported byr Lima et al.17 and Ventura et al.18.
The clinical importance of NO regarding BP has been well defined since this powerful vasodilator directly affects the tonus of peripheral blood vessels and its inhibition generates hypertension 7. Basal NO activity is known to be reduced in hypertensive patients19. Ip et al8 stated that endothelial NO can also play an important role in BP regulation in individuals with OSAHS. However, literature reports have shown that NO deficiency can be reversed in hypertensive individuals by the administration of antihypertensive medications3,20. A study on hypertensive mice demonstrated that, after the use of captopril, no inhibition of NO synthesis was observed, with consequent BP regulation. Another antihypertensive agent that results in BP attenuation and improved NO-mediated vasodilation, is spironolactone20. As already mentioned, basal NO levels in the present study did not differ between the hypertensive individuals with and without OSAHS. It should be pointed out that both groups consisted of hypertensive subjects controlled with antihypertensive medications
Studies conducted on elderly persons have demonstrated an increase in plasma ET-1 levels compared with young individuals4. Zamarron-Sanz et al21 confirmed a significant increase in ET-1 levels in individuals with OSAHS compared to healthy subjects. Jordan et al22 detected increased plasma Big ET-1 levels in a group of patients with OSAHS not receiving clinical or surgical treatment. In the present study there was a higher Big ET-1 concentration in individuals with OSAHS at 7am, after the sleep period.
In general, plasma ET-1 levels tend to be low and there is no consensus on a definitive protocol that would facilitate the reproducible determination of ET-1 or Big ET-1 levels in different biological fluids. There are many variations in the extraction protocols above basal values, ranging from 0.5 to 50 pg/ml, with comparison of the results obtained often being difficult23. In the present study, Big ET-1 determinations showed wide variability although identical processing and storage techniques were used.
Evaluation of the variables in the OSAHS group revealed a negative correlation between SBP and O2 saturation levels, i.e., SBP increased with decreasing arterial oxygenation. Moreover, increased Big ET-1 levels were correlated with higher O2 saturation levels, and SBP was positively correlated with Big ET-1 levels; thus, the greater the vasoconstriction caused by Big ET-1, the higher the SBP. Further, we observed a positive correlation between NAH, AHI, and plasma Big ET-1 levels, suggesting a possible increase in vasoconstriction associated with increasing NAH episodes. No matter how small the number of awakenings among individuals with the syndrome, an increase in sympathetic tonus will occur, with a marked elevation not only of BP, but also of heart rate. Depending on the intensity of sleep apnea, this process may occur hundreds of times during the night24. Thus, NAM during sleep contributes to autonomic hyperactivity as one of the mechanisms that explains hypertension associated with OSAHS25. In the present study, a positive correlation was observed between NAM and DBP (during sleep, wakefulness, and on 24-h ABPM), with the increase in DBP being related to the greater sleep fragmentation during the total sleep time. We did not observe a significant correlation between NAM and SBP (p > 0.05).
Martinez-Garcia et al9 found a more significant correlation between NAM and DBP (during sleep and wakefulness). In contrast, Logan et al26 observed a greater correlation between sleep fragmentation and SBP.
On comparing BMI with NAM, we observed that a higher BMI was correlated with an increase in NAM, suggesting that BMI may interfere with the sleep of individuals with OSAHS. According to Ware, McBrayer and Scott, apnea events are highly sensitive to changes in BMI, i.e., the greater the weight, the higher the probability of apneic events27. As described earlier, obesity is an established, important pathogenic factor for OSAHS14.
Approximately 70% of individuals diagnosed with sleep apnea are considered to be obese according to their BMI, with this being the only significant risk factor that is reversible10. In the present group without OSAHS, an increased number of NAH and an increased AHI were correlated with SBP elevation. Grote et al28 in studying the influence of AHI on BP, observed that the probability of uncontrolled hypertension increases by 2% with each unit increase in AHI.
Antczak et al.29 reported that there is evidence that obesity, even in the absence of respiratory sleep disorders, negatively affects the quality of sleep, increasing daytime somnolence. Furthermore, studies have observed that obese patients without OSAHS had a higher frequency of awakenings during sleep compared with patients of normal weight30,31. On this basis, we believe that, regardless of whether an individual has OSAHS or not, obesity is an extremely important factor regarding the quality of sleep. In the present study, groups did not differ in terms of the prevalence of obesity.
In addition, we observed that obesity negatively influences O2 saturation levels, with an increased BMI causing greater desaturation. When correlating NAM with O2 saturation levels, we observed a decline in saturation with increasing sleep fragmentation.
In conclusion, elderly hypertensive subjects with OSAHS presented a greater Big-ET-1 level after the sleep period regardless of BP, since their BP was controlled and similar to the SBP of hypertensive elderly subjects without OSAHS. In patients with OSAHS, a correlation was observed between Big ET-1 and SBP; Big ET-1 and NAH; and O2 saturation and SBP. In both groups, a higher BMI was correlated with greater desaturation and NAM. NO levels did not differ between the hypertensive patients with or without OSAHS. It is noteworthy that both groups consisted of hypertensive patients controlled with antihypertensive medications.
Conception and design of the research: Anunciato IF, Lima NKC; Acquisition of data: Anunciato IF, Lobo RR, Verri Jr. WA, Eckeli AL, Évora PRB, Nobre F; Analysis and interpretation of the data: Anunciato IF, Lobo RR, Eckeli AL, Lima NKC; Statistical analysis: Coelho EB, Lima NKC; Obtaining funding: Lima NKC; Writing of the manuscript: Anunciato IF, Moriguti JC, Ferriolli E, Lima NKC; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Anunciato IF, Coelho EB, Verri Jr. WA, Évora PRB, Nobre F, Moriguti JC, Ferriolli E, Lima NKC.;
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAEPA.
This article is part of the thesis of master submitted by Iara Felício Anunciato from Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.
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Iara Felicio Anunciato Rua Natalicia Frederico de Vicenti, 30, JD Maria Imaculada I Postal Code 14340-000, Brodowski, SP - Brazil E-mail:
Manuscript received October 11, 2012; revised November 29, 2012; accepted March 15, 2013.