FUNDAMENTO: Estudos de intervenção mostraram aumento da mortalidade em pacientes que receberam betacaroteno. Contudo, não são conhecidos os mecanismos envolvidos nesse fenômeno. OBJETIVO: Avaliar a influência do betacaroteno sobre o estresse oxidativo e a expressão de conexina 43 em coração de ratos. MÉTODOS: Ratos Wistar, pesando aproximadamente 100 g, foram alocados em dois grupos: Grupo Controle (n = 30), que recebeu a dieta usada de rotina em nosso laboratório, e Grupo Betacaroteno (n = 28), que recebeu betacaroteno (na forma de cristal, adicionado e misturado à dieta) na dose de 500 mg de betacaroteno/kg de dieta. Os animais receberam tratamento até que atingissem entre 200 e 250 g, quando eram sacrificados. Foram coletados sangue, fígado e coração para realização de Western blotting e imunoistoquímica para conexina 43; foram realizados estudos morfométricos, dosagens de betacaroteno por cromatografia líquida de alta eficiência bem como de glutationa reduzida, glutationa oxidada e hidroperóxidos de lipídeos por análises bioquímicas. RESULTADOS: O betacaroteno foi detectado apenas no fígado dos animais do Grupo Betacaroteno (288 ± 94,7 µg/kg). Os níveis de glutationa reduzida/glutationa oxidada foram maiores no fígado e no coração dos animais do Grupo Betacaroteno (fígado - Grupo Controle: 42,60 ± 1,62; fígado - Grupo Betacaroteno: 57,40 ± 5,90; p = 0,04; coração: - Grupo Controle: 117,40 ± 1,01; coração - Grupo Betacaroteno: 121,81 ± 1,32 nmol/mg proteína; p = 0,03). O conteúdo de conexina 43 total foi maior no Grupo Betacaroteno. CONCLUSÃO: O betacaroteno apresentou efeito benéfico, caracterizado pelo aumento da comunicação intercelular e melhora do sistema de defesa antioxidante. Nesse modelo, os mecanismos não explicam a maior mortalidade observada com a suplementação de betacaroteno em estudos clínicos. (Arq Bras Cardiol. 2013; [online].ahead print, PP.0-0)
Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Botucatu, SP - Brasil
Junções comunicantes, ou
A redução da comunicação intercelular via junções comunicantes associa-se à ocorrência de arritmias cardíacas5,6 e está presente em diversas situações em que o coração é submetido a algum tipo de agressão. Nesse sentido, já foi verificada alteração nas junções comunicantes em situações de remodelação ventricular, como hipertensão3, insuficiência cardíaca congestiva7 e infarto agudo do miocárdio8.
O betacaroteno é um carotenoide com atividade de pró-vitamina A, presente na dieta de seres humanos, em frutas e vegetais coloridos9,10. Apresenta variedade de funções, incluindo ação antioxidante11 e aumento da comunicação intercelular pelas junções comunicantes em diversos tipos de tecidos do organismo9,12,13. No entanto, não se conhecem estudos que avaliaram os efeitos do betacaroteno em relação à Cx43 no coração.
Estudos de intervenção, delineados para testar a hipótese de que o betacaroteno protegeria os humanos contra o desenvolvimento de câncer ou de doenças cardiovasculares, mostraram aumento de mortes por doenças cardiovasculares nos grupos suplementados com o carotenoide9,14-16. Adicionalmente, estudos realizados na Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) mostraram que a suplementação da dieta de ratos com betacaroteno induziu remodelação ventricular, caracterizada por aumento do diâmetro sistólico do Ventrículo Esquerdo (VE) e diminuição das frações de ejeção e encurtamento ventriculares17. Além disso, em estudo que analisou os efeitos do betacaroteno antes do infarto em ratos normais e fumantes, observou-se que o ele aboliu o efeito paradoxal protetor do fumo induzido pelo cigarro18.
Assim, diante dos efeitos prejudiciais produzidos pelo betacaroteno no coração, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do betacaroteno sobre o estresse oxidativo e a expressão de Cx43 em coração de ratos.
O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da da Faculdade de Medicina de Botucatu, estando em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.
Foram utilizados ratos Wistar, machos, pesando aproximadamente 100 g. Os animais foram alocados, ao acaso, em dois grupos experimentais: Grupo Controle (C), formado por 30 animais, que receberam a dieta usada de rotina na Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX); e Grupo Betacaroteno (BC), composto por 28 animais que receberam betacaroteno (na forma de cristal, adicionado e misturado à dieta) na dose de 500 mg de betacaroteno/kg de dieta. Os animais receberam tratamento até que os atingissem entre 200 e 250 g (entre 4 ea 5 semanas).
Após o fim do período de tratamento, os animais foram sacrificados com uma dose excessiva de anestésico (100 mg/kg de pentobarbital sódico) e, em seguida, foram coletados sangue, fígado e coração para realização do protocolo experimental.
Após eutanásia dos animais, os corações foram removidos e dissecados; os átrios e ventrículos foram separados e pesados. Os pesos do VE e do Ventrículo Direito (VD) foram ajustados pelo peso corporal final do rato e utilizados como índice de hipertrofia ventricular.
Amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol a 10%, segundo método já descrito19. Após fixação, o tecido foi incluso em parafina, obtendo-se, a seguir, cortes de 4 µm. Os cortes histológicos foram corados em lâminas com solução Hematoxilina-Eosina (HE) para aferição das áreas da secção transversa dos miócitos, empregando-se microscópio Leica DM LS acoplado à câmera de vídeo, que envia imagens digitais ao computador dotado de programa de análise de imagens Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Foram mensurados 50 a 70 células por ventrículo analisado20. Os miócitos selecionados estavam seccionados transversalmente e apresentavam forma arredondada e núcleo visível no centro da célula; eles se localizavam na camada subendocárdica da parede muscular do VE. Esse cuidado visou uniformizar ao máximo o conjunto de miócitos dos diferentes grupos. As áreas seccionais médias obtidas para cada grupo foram utilizadas como indicador do tamanho celular.
Para avaliação do interstício do miocárdio do VE, foram feitas lâminas com cortes histológicos coronais de 5 µm, corados pela técnica de
Os experimentos de
A corrida eletroforética foi realizada em gel bifásico de empilhamento (Tris-HCL 240 mM; pH 6,8; poliacrilamida 30%; APS e Temed) e de resolução (Tris-HCL 240 mM; pH 8,8; poliacrilamida 30%; APS e Temed), na concentração de 10% a 120V (PowerPac HC 3.0, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) por 2 horas e 10 minutos. A transferência para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) foi realizada em sistema Mini Trans-Blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), utilizando-se tampão de transferência (Tris 25 mM; glicina 192 mM; metanol 20% e SDS 0,1%). Após transferência, as membranas foram incubadas em solução bloquedora a 0,5% de leite em pó desnatado, dissolvido em tampão TBS pH 7,4 (Tris HCl 20 mM; NaCl 137 mM e detergente Tween 20 0,1%) por 2 horas, em temperatura ambiente. Após esse período, a membrana foi lavada três vezes em solução basal (Tris 1M pH 2,8; NaCl 5M e Tween 20) e incubada com os anticorpos primários diluídos na solução bloqueadora, sob agitação constante por 12 horas. Após incubação com anticorpo primário Mouse Monoclonal to GJA1 (Abcam) - para Cx43 total, na concentração de 1:250, e Mouse Monoclonal Anti-Connexin-43 (Zymed) - para Cx43 não fosforilada, na concentração de 3µg/mL, a membrana foi lavada em solução basal e incubada com o anticorpo secundário (1:10.000) IgG anti-mouse HRP (Sigma), em solução bloqueadora, por 2 horas em temperatura ambiente sob agitação constante.
A imunodetecção foi realizada por meio do método de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante (Enhancer Chemi-Luminescence, Amersham Biosciences, NJ-USA).
O anticorpo de normalização utilizado correspondeu ao GAPDH, Mouse IgG1 (ABR, Affinity BioReagents, Golden, CO, USA) (1:10.000).
As análises quantitativas dos
Os experimentos de imunoistoquímica foram realizados segundo Saffitz e cols.23, com algumas modificações. Fragmentos do miocárdio ventricular esquerdo, fixados sucessivamente em formaldeído a 10% por 24 horas, água corrente por 24 horas e álcool 70º por 24 horas, foram emblocados em parafina e, em seguida, feitos cortes histológicos de 3 m. Em seguida, os cortes permaneceram em estufa a 60ºC, durante 24 horas. A desparafinização foi feita em banhos sucessivos de xilol, álcool 100º, álcool 95º e álcool 70º, seguida de hidratação em água destilada. Os cortes histológicos foram colocados em solução de ácido cítrico a 0,01M, pH 6,0 e submetidos a ambiente de micro-ondas por 10 minutos, para recuperação antigênica. Após resfriamento de 20 minutos, as lâminas foram lavadas em tampão fosfato de sódio (PBS) pH 7,2 e incubadas por 30 minutos em solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% (solução de BSA em PBS), para bloqueio de reações inespecíficas. Em seguida, foram incubadas
Após esse período, as lâminas foram lavadas em PBS, e os cortes foram incubados com anticorpo secundário (Texas Red anti-rabbit IgG; Vector), na diluição de 1:50, por 1 hora, em temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas em PBS e cobertas com meio de montagem, composto de glicerina tamponada e lamínula. Para cada bateria de reações de imunoistoquímica realizada (dez lâminas), o controle negativo correspondeu a uma lâmina de VE em que se omitiu o anticorpo primário.
A leitura foi feita utilizando-se microscópio equipado com unidade de epifluorescência (Carl-Zeiss, Inc. North America) acoplado à câmera de vídeo (AxioPlan 4.1; Carl-Zess Inc.) utilizando aumento de 40x. O filtro utilizado foi o verde (WG), com comprimento de onda de excitação a 550 nm e emissão a 650 nm.
As concentrações de betacaroteno, no soro, foram quantificados segundo Yeum e cols.24 e, no fígado e no coração, foram dosadas segundo Paiva e cols.25. A metodologia utilizada foi a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com cromatógrafo Alliance 2695 (Waters) acoplado a detector PDA 2996 (Waters). A coluna analítica utilizada correspondeu a C30 (Waters -YMC carotenoid: 4,6 x 150 mm; 3,0 µm). O betacaroteno foi quantificado pela determinação da área do pico da amostra/área pico do padrão interno. Os valores obtidos foram corrigidos quanto a perdas durante a extração e manipulação das amostras pela recuperação do padrão interno.
O estudo do estresse oxidativo foi realizado segundo Azevedo e cols.26. Amostras de aproximadamente 200 mg de tecido (VE ou fígado) foram homogeneizadas com 5 mL de tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,0, sob gelo, em homogeneizador. Os homogeneizados foram centrifugados (10.000 rpm) por 15 minutos, em centrífuga refrigerada a -4ºC. Os sobrenadantes obtidos foram utilizados para determinação da concentração de Glutationa Reduzida (GSH), Glutationa Oxidada (GSSG) e hidroperóxidos de lipídeos. As leituras espectrofotométricas foram obtidas em leitor ELISA (Biotek Instruments, INC) e em espectrofotômetro Pharmacia Biotech (England).
Os hidroperóxidos de lipídeos foram determinados pela oxidação do Fe+2 (sulfato ferroso amoniacal). O Fe+3 formado reage com alaranjado de xilenol, formando um composto colorido. As leituras foram realizadas com comprimento de onda de 560 nm.
A concentração de GSH (grupos SH não proteicos) foi determinada em tampão tris-HCl, pH 8,9, e 5,5'-dithiobis (ácido 2-nitro-benzoico), (DTNB) após prévia precipitação com ácido tricloroacético (TCA) 50%. Como padrão, foi utilizada GSH 1 mM27. A concentração de GSSG foi determinada pela diferença entre GSH total e GSH reduzida, sendo a proporção estequiométrica (2GSH:GSSG)28.
Os resultados de cada variável, para cada grupo experimental, foram submetidos à verificação da normalidade e de igualdade de variância. Como em todas as comparações essas condições foram atendidas, foi realizado teste
No soro e no coração, não foi detectada presença de betacaroteno. No fígado, apenas os animais do Grupo BC apresentaram concentrações detectáveis desse carotenoide (288 ± 94,7 µg/kg).
Todos os animais apresentaram peso corpóreo entre 200 e 250 g, não havendo diferença estatisticamente significante entre os Grupos C e BC (
Não se detectou diferença significante entre os Grupos C e BC quanto à localização e à intensidade de marcação (quantidade) para Cx43 (
As concentrações de GSH/GSSG foram maiores no fígado e no coração dos animais do Grupo BC em relação ao Grupo C. Quanto às demais variáveis, não se observou diferença estatística entre os grupos experimentais (
O presente estudo foi realizado para analisar os efeitos do betacaroteno sobre a comunicação intercelular e o estresse oxidativo em coração de ratos. Este estudo observou que esse carotenoide aumenta a expressão de Cx43 bem como a defesa antioxidante do coração.
Quanto aos efeitos antioxidantes do betacaroteno, vitaminas antioxidantes têm sido estudadas devido à sua capacidade de prevenir doenças crônicas, entretanto, o uso desses compostos em doenças cardiovasculares permanece controverso. Discrepâncias nos resultados obtidos podem ser relacionadas a características individuais ou às doses de antioxidantes utilizadas29,30.
A ação antioxidante do betacaroteno é bem caracterizada na literatura. Em diversos estudos, com animais e humanos, ele oferece proteção contra danos oxidativos10. Também após injúrias cardíacas, o uso de antioxidantes tem efeito benéfico31,32. Como o estresse oxidativo está envolvido na etiologia e na progressão de várias doenças crônicas no coração, antioxidantes como o betacaroteno são considerados importantes estratégias na prevenção dessas doenças30,33. No presente estudo, o betacaroteno apresentou ação antioxidante, caracterizada pelo aumento da relação GSH/GSSG em coração e fígado de ratos, protegendo, assim, o sistema antioxidante total.
Outro efeito do betacaroteno, neste estudo, correspondeu à atenuação dos níveis de colágeno no tecido cardíaco. Em situações de agressão ao coração, é conhecida a participação de radicais livres no processo de remodelação ventricular33-35, bem como a prevenção ou a atenuação desse processo, quando são utilizados antioxidantes32,36.
Dentre as alterações morfológicas observadas durante o processo de remodelação, encontra-se a fibrose intersticial37. Estudos mostram que o estresse oxidativo induz à síntese de colágeno, produzindo, consequentemente, fibrose no tecido cardíaco34,36. Dentre os mecanismos, tem sido observado que os radicais livres induzem a expressão de TGFβ1, fator de crescimento que atua aumentando a síntese de colágeno, além de suprimir sua degradação no tecido cardíaco36.
Este estudo está em consonância com tal conceito, já que a diminuição do estresse oxidativo foi associada à diminuição na quantidade de colágeno. Assim, pode-se sugerir que a atenuação dos níveis de colágeno, no presente estudo, tenha ocorrido devido à melhora do sistema antioxidante relacionado à suplementação da dieta com betacaroteno10,12.
Quanto ao aumento da expressão de Cx43 no tecido cardíaco, induzido pelo betacaroteno neste estudo, este foi um achado de grande importância, uma vez que a estimulação da comunicação intercelular por carotenoides é bem documentada na literatura em outros tecidos, sendo considerada um dos mecanismos da ação preventiva contra o câncer9,10,13. Além disso, tem sido mostrado que o betacaroteno aumenta a expressão de Cx43 em diversos tecidos, como fibroblastos humanos e de camundongo38,39, linhagens celulares de adenocarcinoma de pulmão humano13 e células hepáticas de rato40. Em relação ao efeito do betacaroteno na carcinogênese, os carotenoides, pelo aumento na expressão de Cx43, restauram a comunicação intercelular, efeito que se correlaciona à inibição do crescimento de células quimicamente transformadas9.
No presente estudo, o efeito de aumentar expressão de Cx43 induzido pelo betacaroteno ocorreu em corações não agredidos. Esse achado está em concordância com os demais resultados publicados na literatura, na qual é observado o aumento da expressão de Cx43 por ação desse carotenoide em vários tipos de tecidos do organismo9,38. Assim, neste modelo experimental, a suplementação da dieta com o betacaroteno não se comporta como agressão, já que, em corações agredidos, observa-se redução da expressão de Cx433,7,8. Adicionalmente, essa alteração não explica o aumento de eventos adversos observados em estudos de intervenção com o betacaroteno.
Os mecanismos pelos quais o betacaroteno aumenta a expressão de Cx43 ainda não são completamente conhecidos. No entanto, é possível inferir que essa ação dos carotenoides não se deve exclusivamente à atividade de pró-vitamina A e nem à atividade antioxidante desses compostos. Essa afirmação se baseia no fato de que carotenoides sem atividade de pró-vitamina também exercem esse efeito e outros antioxidantes, como alfa-tocoferol, não o exercem10.
Em conclusão, o betacaroteno, no modelo experimental utilizado no presente estudo, apresenta efeito benéfico, caracterizado pelo aumento da comunicação intercelular e do sistema de defesa antioxidante.
Concepção e desenho da pesquisa: Novo R, Paiva SAR; Obtenção de dados: Novo R, Azevedo PS, Paiva SAR; Análise e interpretação dos dados: Novo R, Azevedo PS, Minicucci MF, Zornoff LAM, Paiva SAR; Análise estatística: Minicucci MF; Redação do manuscrito: Novo R, Minicucci MF, Paiva SAR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Rosângela Novo pela Faculdade de Medicina de Botucatu.
Leonardo A. M. Zornoff Departamento de Clínica Médica, Rubião Jr. CEP 18618-970, Botucatu, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 23/4/13; revisado em 24/4/13; aceito em 27/5/13.
BACKGROUND: Intervention studies have shown an increased mortality in patients who received beta-carotene. However, the mechanisms involved in this phenomenon are still unknown. OBJECTIVE: Evaluate the influence of beta-carotene on oxidative stress and the expression of connexin 43 in rat hearts. METHODS: Wistar rats, weighing approximately 100 g, were allocated in two groups: Control Group (n=30), that received the diet routinely used in our laboratory, and Beta-Carotene Group (n = 28), which received beta-carotene (in crystal form, added and mixed to the diet) at a dose of 500 mg of beta-carotene/kg of diet. The animals received the treatment until they reached 200-250g, when they were sacrificed. Samples of blood, liver and heart were collected to perform Western blotting and immunohistochemistry for connexin 43; morphometric studies, dosages of beta-carotene by high-performance liquid chromatography as well as reduced glutathione, oxidized glutathione and lipids hydroperoxides were performed by biochemical analysis. RESULTS: Beta-carotene was detected only in the liver of Beta-Carotene Group animals (288 ± 94.7 µg/kg). Levels of reduced/oxidized glutathione were higher in the liver and heart of Beta-Carotene Group animals (liver - Control Group: 42.60 ± 1.62; liver - Beta-Carotene Group: 57.40 ± 5.90; p = 0.04; heart: - Control Group: 117.40 ± 1.01; heart - Beta-Carotene Group: 121.81 ± 1.32 nmol/mg protein; p = 0.03). The content of total connexin 43 was larger in Beta-Carotene Group. CONCLUSION: Beta-carotene demonstrated a positive effect, characterized by the increase of intercellular communication and improvement of anti-oxidizing defense system. In this model, mechanism does not explain the increased mortality rate observed with the beta-carotene supplementation in clinical studies. (Arq Bras Cardiol. 2013; [online].ahead print, PP.0-0)
Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Botucatu, SP - Brazil
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Communicating junctions, or gap junctions, are specialized intercellular contact regions that connect the cytoplasm of adjacent cells, allowing electrical and metabolic coupling1. Each communicating junction consists of proteins called Connexins (Cx). More than 20 coding genes of Cx were identified. In the heart, the three main isoforms correspond to Cx40, Cx43 and Cx45, being Cx43 more abundant in atrial and ventricular myocytes, and in distal parts of the conduction system2-4.
Reduction of intercellular communication via communicating junctions is related to cardiac arrhythmia5,6 and is present in several situations in which the heart is subjected to any form of aggression. In this case, changes on communicating junctions were verified in ventricular remodeling situations, such as hypertension3, congestive heart failure7 and acute myocardium infarction8.
Beta-carotene is a carotenoid with pro-vitamin A activity, present in human diet, fruits and colored vegetables9,10. It has a variety of functions, including antioxidant action11 and increase of intercellular communication through communicating junctions in several types of tissues of the body9,12,13. However, there are not known studies to evaluate the effects of beta-carotene in relation to Cx43 in the heart.
Intervention studies, designed to test the hypothesis that beta-carotene would protect humans against the development of cancer or cardiovascular diseases, showed increased cardiovascular death rate in groups supplemented with carotenoid9,14-16. Additionally, studies performed in Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) showed the supplementation of rat diet with beta-carotene induced ventricular remodeling, characterized by increased systolic diameter of the Left Ventricle (LV) and decreased ejection fractions and ventricular shortening17. Moreover, in a study that analyzed the effects of beta-carotene before infarction in normal and smoking rats, it was observed that it eliminated the paradoxical cigarette smoke-induced protective effect18.
Therefore, in face of the negative effects produced by beta-carotene in the heart, the objective of this study is to evaluate the influence of beta-carotene on oxidative stress and Cx43 expression in rat hearts.
The experimental protocol was approved by Ethics Commission in Animal Testing of Faculdade de Medicina de Botucatu, and it complies with Ethical Principles of Animal Testing, adopted by the Brazilian College of Animal Testing.
We used Wistar male rats, weighing approximately 100 g. The animals were allocated, randomly, in two experimental groups: Control Group (C), consisting of 30 animals, that received the diet routinely used in Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX); and Beta-Carotene Group (BC), consisting of 28 animals which received beta-carotene (in crystal form, added and mixed to the diet) at a dose of 500mg of beta-carotene/kg diet. The animals received the treatment until they reached 200-250 g (between 4 and 5 weeks).
After the end of the treatment, the animals were sacrificed with an excessive dose of anesthetic (100 mg / kg of pentobarbital sodium) and, subsequently, blood, liver and heart samples were collected for performing the experimental protocol.
After euthanizing the animals, their hearts were removed and dissected; atria and ventricles were separated and weighed. The weighs of LV and Right Ventricle (RV) were adjusted according to final body weight of the rat and used as ventricular hypertrophy index.
Heart tissue samples were fixed in formalin solution at 10%, according to method previously described19. After fixation, the tissue was placed in paraffin, subsequently obtaining sections measuring 4 µm. Histological sections were stained in microscope slides with Haematoxylin-Eosin (HE) solution for analyzing areas of the myocytes cross-section, using Leica DM LS microscope coupled to video camera, which sends digital images to computer with the image analysis program Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). We measured 50-70 cells per analyzed ventricle20. Myocytes selected were cross-sectioned and had rounded shape and visible core in the center of the cell; they were located in the subendocardial layer of LV muscular wall. This procedure aimed at standardizing to the fullest extent the set of myocytes from different groups. Mean sectional areas obtained for each group were used as an indicator of cell size.
For evaluating LV myocardium interstitium, slides with coronary histological sections of 5 µm, stained by the Picrosirius red technique and specific for visualization of collagen. Reading was performed using Leica DM LS microscope coupled to video camera, which sends digital images to computer with image analysis program Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). We analyzed 30-40 fields per ventricle20, using a 40X objective. Fields chosen were distant from the perivascular region.
Western blotting experiments were performed in compliance with Rolim et al21, with a few modifications22. LV samples were homogenized using the device Polytron (Ika Ultra-Turrax® T25 Basic, Wilmington, USA) with hypotonic lysis buffer (50 mM potassium phosphate; 7.0 pH; 0.3M sucrose ; 0.5mM DTT; 1mM EDTA; 8.0 pH; 0.3 mM PMSF; 10 mM NaF and phosphatase inhibitor) and centrifuged (Eppendorf 5804R, Hamburg, Germany) at 12,000rpm, for 20 minutes, at 4ºC. Protein concentration was analyzed through Bradford method, using BSA Protein Assay Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) curves as standard, with 595nm absorbance reading.
Electrophoretic run was performed in biphasic stacking gel (240mM Tris-HCL; 6.8 pH; 30% polyacrylamide; APS and Temed) and running gel (240mM Tris-HCL; 8.8 pH; 30% polyacrylamide; APS and Temed), at 10% concentration at 120V (PowerPac HC 3.0, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) for 2 hours and 10 minutes. Transfer to nitrocellulose membrane performed in Mini Trans-Blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) system, using a transfer buffer (25mM Tris; 192mM glycine; 20% methanol and 0.1% SDS). After transfer, the membranes were incubated in blocking solution at 0.5% of skimmed milk powder, dissolved in buffer 7.4 pH TBS (20mM HCl Tris; 137mM NaCl and detergent 0.1% 20 Tween) for 2 hours, in ambient temperature. After this period, the membrane was rinsed three times in basal solution (Tris 1M; 2.8 pH; 5M NaCl and Tween 20) and incubated with primary antibodies diluted in blocking solution, under constant agitation for 12 hours. After incubation with primary antibody Mouse Monoclonal to GJA1 (Abcam) - for total Cx43, at a concentration of 1:250, and Mouse Monoclonal Anti-Connexin-43 (Zymed) - for non-phosphorylated Cx43, at a concentration of 3µg/mL, the membrane was rinsed in basal solution and incubated with secondary antibody (1:10,000) IgG anti-mouse HRP (Sigma), in blocking solution, for 2 hours under ambient temperature and constant agitation.
Immunodetection was performed through chemiluminescence method according to manufacturer's instructions (Enhancer Chemi-Luminescence, Amersham Biosciences, NJ-USA).
The normalization antibody we used corresponded to GAPDH, Mouse IgG1 (ABR, Affinity BioReagents, Golden, CO, USA) (1:10,000).
Quantitative analysis of blots we obtained were performed using the program Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA), in free software, available at the website
Immunohistochemistry experiments were performed in compliance with Saffitz et al23, with a few modifications. Fragments of the left ventricular myocardium, successively fixed in formaldehyde at 10%º for 24 hours, were immersed in paraffin and, subsequently, histological sections of 3 µm were made. Then, the sections were kept incubated at 60ºC, during 24 hours. Deparaffinization was performed in successive immersions in xylene, alcohol 100º, alcohol 95º and alcohol 70º, followed by hydration in distilled water. Histological sections were placed in citric acid solution at 0.01M, 6.0 pH and subjected to microwave environment for 10 minutes, for antigen recovery. After 20 minutes of cooling process, slides were rinsed in 7.2 pH sodium phosphate buffer (PBS) and incubated for 30 minutes in bovine serum albumin (BSA) solution at 3% (BSA solution in PBS), for blocking unspecific reactions. Subsequently, they were incubated overnight at 4ºC in humid chamber with primary antibody (Rabbit Polyclonal Anti-Connexin 43; Abcam), diluted at 1:100.
After this period, the slides were rinsed in PBS, and sections were incubated with secondary antibody (Texas Red anti-rabbit IgG; Vector), diluted at 1:50, for 1 hour, in ambient temperature. Then, slides were rinsed in PBS and covered with mounting medium, composed by buffered glycerin and microslide. For each battery of immunohistochemical reactions performed (ten slides), the negative control corresponded to one LV slide, in which the primary antibody was omitted.
Reading was performed through a microscope embedded with an epifluorescence unit (Carl-Zeiss, Inc. North America) coupled to a video camera (AxioPlan 4.1; Carl-Zeiss Inc.) using 40x augmentation. We used the green filter (WG), with 550 nm excitation wavelength and 650nm emission.
Beta-carotene concentrations, in serum, were quantified according to Yeum et al24 and, in liver and heart, they were dosed according to Paiva et al25. The methodology used was high-performance liquid chromatography (HPLC), with chromatograph Alliance 2695 (Waters) coupled to detector PDA 2996 (Waters). Analytical column corresponded to C30 (Waters -YMC carotenoid: 4.6 x 150mm; 3.0µm). Beta-carotene was quantified by determining the sample/internal standard peak area. Values obtained were corrected according with losses during samples extraction and handling for recovery of internal standard.
The study of oxidative stress was performed in accordance with Azevedo et al26. Samples of approximately 200 mg of tissue (LV or liver) were homogenized wit 5mL of 0.1M sodium phosphate buffer, 7.0 pH, under ice, in homogenizer. The homogenized samples were centrifuged (10,000 rpm) for 15 minutes, in refrigerated centrifuge at -4ºC. Supernatants obtained were used to determine the concentration of Reduced Glutathione (GSH), Oxidized Glutathione (GSSG) and lipids hydroperoxides. Spectrophotometric readings were obtained via ELISA (Biotek Instruments, INC) reader, and in spectrophotometry Pharmacia Biotech (England).
Lipids hydroperoxides were determined by Fe+2 oxidation (ferrous ammonium sulphate). Fe+3 reacts with orange xylenol, forming a colored compound. Readings were performed with a 560nm wavelength.
GSH (non-protein groups of SH) concentration was determined in buffer tris-HCl, 8.9 pH, and 5.5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), (DTNB) after previous precipitation with trichloroacetic acid (TCA) 50%. As standard, we used GSH 1 mM27. GSSG concentration was determined by the difference between total GSH and reduced GSH, being the stoichiometric ratio (2GSH:GSSG)28.
Results of each variable, for each experimental group, were tested for normality and variance equality. Since in all comparisons these conditions were met, Student
In serum and heart, beta-carotene presence was not detected. In liver, only BC Group animals showed detectable concentrations of this carotenoid (288 ± 94.7 µg/kg).
All animals had body weight between 200 and 250 g, and there was no statistically relevant difference between C and BC Groups (
No significant difference was detected between C and BC Groups regarding location and staining intensity (quantity) for Cx43 (
GSH/GSSG concentrations were higher in liver and heart of BC Group compared to C Group. As for other variables, no statistic difference was noticed between the experimental groups (
This study was performed to analyze the effects of beta-carotene on intercellular communication and oxidative stress in rats' heart. This study found carotenoid increases Cx43 expression, as well as heart defense antioxidant.
As for the effects of beta-carotene antioxidants, antioxidant vitamins have been studied due to their capacity of preventing chronic diseases, however, using these compounds for cardiovascular diseases remains controversial. Discrepancies in results obtained can be related to individual characteristics or administered antioxidant doses29,30.
Beta-carotene antioxidant activity is well characterized in literature. In several studies, with animals and humans, it offers protection against oxidative damages10. Also after heart injuries, using antioxidants has a positive effect31,32. Since the oxidative stress is involved in etiology and progression of several heart chronic diseases, antioxidants, such as beta-carotene, are considered important strategies in the prevention of these diseases30,33. In this study, beta-carotene showed an antioxidant activity, characterized by the increased GSH/GSSG relation in heart and liver of rats, thus protecting the total antioxidant system.
Another beta-carotene effect, in this study, corresponded to decreased collagen levels in heart tissue. In cases of aggression to the heart, it is known the participation of free radicals in ventricular remodeling process33-35, as well as prevention or attenuation of this process, when antioxidants are used32,36.
Among morphological changes observed during the remodeling process, is interstitial fibrosis37. Studies have shown that oxidative stress induces collagen synthesis, producing, consequently, fibrosis in heart tissue34,36. Among mechanism, it has been observed that free radicals induce the expression of TGFβ1, growth factor that increases the collagen synthesis, in addition to suppressing its degradation in heart tissue36.
This study is in compliance with such concept, since the decrease of oxidative stress was associated with a decreased collagen quantity. Thus, we may suggest the decreased collagen levels, in this study, occurred due to an improvement in the antioxidant system, related to the diet supplemented with beta-carotene10,12.
Regarding the increased expression of Cx43 in heart tissue, induced by beta-carotene in this study, this was a very relevant finding, once stimulating intercellular communication using carotenoids is frequently documented in the literature of other tissues, being considered one of the mechanisms that prevent cancer9,10,13. Moreover, it has been demonstrated that beta-carotene increases the expression of Cx43 in several tissues, such as human and mouse fibroblasts38,39, adenocarcinoma cell lines in human lung13 and rat liver cells40. In relation to beta-carotene effect on carcinogenesis, carotenoids, with the increased expression of Cx43, restore intercellular communication, an effect that is correlated to growth inhibition of chemically transformed cells9.
In this study, the effect of increased expression of Cx43 induced by beta-carotene occurred in non-damaged hearts. This finding is in compliance with other results published in the literature, in which it is observed the increased expression of Cx43 due to this carotenoid in several types of tissues of the body9,38. Thus, in this experimental model, the supplementation of diet with beta-carotene does not behave as aggression, since, in damaged hearts, there is a decreased expression of Cx433,7,8. Additionally, this change does not explain the increased adverse events observed in intervention studies with beta-carotene.
Mechanisms through which beta-carotene increases the expression of Cx43 are yet not completely known. However, it is possible to infer that this activity of carotenoids is not exclusively due to pro-vitamin A activity nor the antioxidant activity of these compounds. This affirmation is based on the fact that carotenoids without pro-vitamin activity also have this effect, and other antioxidants, such as alpha-tocopherol, do not10.
In conclusion, beta-carotene, in the experimental model used in this study, has a positive effect, characterized by the increased intercellular communication and antioxidant defense system.
Conception and design of the research: Novo R, Paiva SAR; Acquisition of data: Novo R, Azevedo PS, Paiva SAR; Analysis and interpretation of the data: Novo R, Azevedo PS, Minicucci MF, Zornoff LAM, Paiva SAR; Statistical analysis: Minicucci MF; Writing of the manuscript: Novo R, Minicucci MF, Paiva SAR; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Rosângela Novo, from Faculdade de Medicina de Botucatu.