O etanercepte induz QRS de baixa tensão e disfunção autonômica em camundongos com doença de Chagas experimental

Héctor Rodríguez-Angulo^I; Oscar García^II; Endher Castillo^II; Edward Cardenas^II; Juan Marques^III; Alfredo Mijares^I

^IInstituto Venezuelano de Investigações Científicas (IVIC) - Centro de Biofísica e Bioquímica, Caracas, Venezuela

^IIUniversidade Centro Ocidental "Lisandro Alvarado" - Decanato de Ciências de la Saúde, Barquisimeto, Venezuela

^IIIServiço de Cardiologia, Instituto de Medicina Tropical - Universidade Central da Venezuela, Venezuela

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A doença de Chagas é uma doença parasitária tropical causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A cardiomiopatia chagásica é caracterizada por distúrbios na regulação autonômica e na condução do potencial de ação nas fases aguda e crônica da infecção. Embora o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) tenha sido associadoà cardiomiopatia em modelos experimentais e em pacientes com doença de Chagas, outros relatos sugerem que o TNF-α pode exercer ações antiparasitárias durante a fase aguda da infecção.

OBJETIVOS: Este estudo teve como objetivo determinar os efeitos de um blocker TNF-α solúvel, o etanercepte, em parâmetros eletrocardiográficos na fase aguda da infecção experimental com Trypanosoma cruzi.

MÉTODOS: Foram feitos eletrocardiogramas em camundongos infectados não tratados e camundongos infectados que foram tratados com etanercepte 7 dias após a infecção. Os parâmetros de variabilidade onda do eletrocardiograma e frequência cardíaca foram determinados utilizando o Chart para Windows.

RESULTADOS: O tratamento com etanercepte resultou em uma baixa tensão do complexo QRS e uma redução da variabilidade da frequência cardíaca em comparação com a ausência de tratamento. No entanto, os camundongos tratados apresentaram um atraso na queda da curva de sobrevivência durante a fase aguda.

CONCLUSÃO: Os resultados deste estudo sugerem que, embora o tratamento com etanercepte promova a sobrevivência em camundongos infectados com uma linhagem virulenta de T. cruzi, o bloqueio do TNF-α gera um complexo de baixa tensão e disfunção autonômica durante a fase aguda da infecção. Esses resultados indicam que a mortalidade durante a fase aguda pode ser atribuída a uma resposta inflamatória sistêmica, em vez da disfunção cardíaca.

Palavras-chave: Camundongos, Doença de Chagas, Imunogobulina G / efeitos adversos, Sistema Nervoso, Etanercepte.

Introdução

A cardiomiopatia Chagásica (CC) é uma das consequências mais devastadoras da doença de Chagas, infecção intracelular causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, e está intimamente relacionada à mortalidade na fase crônica da infecção¹. A CC aflige cerca de 10 a 30% dos pacientes infectados, e é caracterizada pela dilatação de ambos os ventrículos, aneurisma apical e distúrbios de condução como bloqueio do ramo direito e bloqueio atrioventricular². O papel dos mediadores inflamatórios na evolução da CC permanece controverso³.

O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina produzida principalmente por macrófagos, linfócitos B e T e outras linhagens celulares, tais como células endoteliais, neurônios e cardiomiócitos. Ela é produzida em resposta a estímulos inflamatórios e infecciosos⁴, e é inicialmente sintetizada como uma molécula transmembrana, clivada por uma metaloprotease conversora do TNF-α (TACE ou ADAM17), e secretada como um monômero agrupado para formar trímeros biologicamente ativos⁵. O TNF-α se liga a receptores específicos de membrana (receptores de TNF - TNFRs), que são o p55TNFR (TNFR1) e o p75TNFR (TNFR2), ativando as vias de sinalização do fator nuclear kappa-B (NF-kB) e da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK)⁶. O etanercepte (Enbrel^®) é uma proteína de fusão dimérica que compreende a porção de ligação ao ligando extracelular do 75-kDa TNFR humano (p75) ligada à porção Fc da IgG1 humana⁴.

O TNF-α tem sido associado à evolução da CC. Lula e colegas relataram altos níveis séricos de ligantes de TNF em pacientes com disfunção cardíaca sem arritmias associadas⁷. Outros relatos demonstraram que a sinalização mediada por TNF / TNFR1 promove miocardite por estimular a infiltração de células CD8+⁸. Sabe-se que o bloqueio TNF-α diminuiu a CC em modelos experimentais^8,9. No entanto, tem sido reportado o agravamento da disfunção ventricular na doença de Chagas crônica experimental causada por bloqueio do TNF-α com etanercepte¹⁰. Portanto, o papel do TNF-α na fisiopatologia da CC permanece obscuro. Além disso, há pouca informação sobre o papel das citocinas pró-inflamatórias na integridade da condução do potencial de ação cardíaco na doença de Chagas. Portanto, o presente estudo teve como objetivo determinar os efeitos do etanercepte nos parâmetros ecocardiográficos durante a fase aguda da infecção induzida por um tipo selvagem de linhagem virulenta de T. cruzi em camundongos experimentais.

Métodos

Cuidados com os animais

Camundongos machos NMRI (linhagem IVIC) pesando 30 g foram alojados em gaiolas transparentes medindo 40 × 25 × 15 cm (cinco camundongos por gaiola) colocadas em uma sala com temperatura e umidade controladas e ciclo de luz claro/escuro de 12h/12h. Todos os camundongos tinham livre acesso a comida e água e foram habituados a essas condições durante uma semana. Todos os procedimentos experimentais estavam de acordo com o Manual de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (Care and Use Handbook of Laboratory Animals) publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (US National Institute of Health - publicação NIH No. 85-23, revisada em 1996).

Depois da habituação, eram administrados nos camundongos 100 µL de injeções intraperitoneais com 1000 tripomastigotas derivados de cultura de células Vero por grama. O inóculo era um isolado selvagem venezuelano de T. cruzi. Atualmente essa linhagem está sendo caracterizada por biologia molecular no nosso laboratório. O isolado foi obtido de uma amostra de Panstrongylus geniculatus capturada de uma comunidade rural no estado de Miranda, e foi mantido por passagens sucessivas em células Vero. Camundongos infectados e não infectados foram alojados em gaiolas separadas dentro do ambiente controlado.

Tratamento com Etanercepte

Os camundongos infectados foram divididos em um grupo não tratado (n = 9) e um grupo tratado (n = 13). Uma dose única de etanercepte foi administrada por via intraperitoneal (0,83 mg / kg) 7 dias após a infecção, utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 27,5. O volume máximo de injeção foi de 100 µL.

Os camundongos foram previamente anestesiados com 40 mg / kg de tiopental (sal de sódio) por via intraperitoneal. O Eletrocardiograma (ECG) foi realizado utilizando um sistema bipolar no qual os eletrodos foram colocados por via subcutânea na cartilagem xifóide (eletrodo positivo), no ombro direito (negativo), e no ombro esquerdo (referência). Os eletrodos foram conectados a um amplificador BioAmp (AD Instruments ^®, Bella Vista, Austrália) e foram digitalizados através de um conversor A / D PowerLab 8SP (AD Instruments ^®). Os registros digitais foram analisados com o software Chart para Windows versão 7.3.1 (AD Instruments ^®). Os eventos foram registados a 4 K / s, e foram filtrados a 60 Hz. Os registos eletrocardiográficos foram obtidos por cinco minutos antes da infecção (saudável) e em 7 e 14 dias após a infecção (antes e após o tratamento, respectivamente).

A variabilidade da frequência cardíaca (VFC) foi determinada utilizando o módulo HRV do Chart para Windows. Cada registro foi cuidadosamente revisto e os complexos QRS foram classificados como complexos normais, artefatos ou batimentos ventriculares prematuros para criar uma série temporal e calcular os intervalos R-R e o desvio padrão do intervalo R-R (SDNN). Além disso, os intervalos P-R, QRS e QTc e as amplitudes P e R foram calculados usando o módulo de análise ecocardiográfica do Chart para Windows, usando um complexo QRS murino normal de 10 ms como referência. O intervalo QT foi ajustado para a frequência cardíaca usando o método de Bazett¹¹. Além disso, a morfologia das ondas do ECG foi avaliada qualitativamente usando como referência registros de ECG obtidos do mesmo animal quando ele estava saudável. Finalmente, a amplitude e a inclinação da onda T foram calculadas utilizando a Análise de Pico do Chart (v7) ^®. O limiar de detecção do pico foi ajustado para um aumento de 5% nos valores de referência da tensão¹¹.

Os dados estão expressos como média ± desvio padrão, e foram comparados usando o teste t de Student pareado. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos. As curvas de sobrevivência foram comparadas usando o teste de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Todas as análises foram realizadas utilizando o Prism5 ^® (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA).

Resultados

A sobrevida foi determinada durante a fase experimental aguda tanto no grupo tratado quanto no grupo não tratado. Como mostra a Figura 1, o grupo tratado apresentou um aumento significativo na sobrevida quando comparado ao grupo não tratado. A sobrevida começou a decrescer rapidamente 20 dias após a infecção no grupo tratado e 11 dias após a infecção no grupo não tratado.

Para avaliar a função cardíaca durante a fase aguda, os registros eletrocardiográficos foram obtidos antes da infecção e 14 dias após a infecção (depois do tratamento). A Figura 2A mostra que a tensão no complexo QRS e nas ondas P foi significativamente menor no grupo tratado do que no grupo não tratado (Tabela 1). Além disso, o grupo tratado mostrou uma tendência não significativa de aumento nos intervalos P-R e R-R (Tabela 1, Figura 2B). Os valores para os demais parâmetros mensurados são apresentados na Tabela 1.

Por fim, nós observamos que a dispersão no gráfico de Poincaré 14 dias após a infecção foi menor para os animais tratados do que para os animais não tratados (Figura 3). A VFC representa uma comparação entre um dado valor do intervalo R-R e o intervalo R-R sucessivo, que é uma avaliação indireta da regulação autonômica cardíaca. A disfunção autonômica é refletida na alteração na capacidade de regulação da frequência cardíaca em resposta às variações fisiológicas e patológicas. Neste estudo, observou-se uma diminuição na SDNN, conforme apresentado na Tabela 1.

Discussão

O papel do TNF-α no controle da infecção por T. cruzi e as alterações patológicas que ocorrem durante a CC têm sido motivo de discussões nos últimos anos. Inicialmente, acreditava-se que o TNF-α e o IFN-γ estavam relacionados com a ativação de macrófagos e a resistência à infecção em camundongos que foram experimentalmente infectados com T. cruzi^12,13. No entanto, estudos posteriores estabeleceram que, embora o TNF-α desempenhe um papel protetor durante a fase inicial da infecção, níveis elevados dessa substância promovem a caquexia e aumentam a mortalidade durante a fase aguda da infecção¹⁴. Desse ponto de vista, o bloqueio do TNF-α melhora a miocardite experimental aguda⁸. Na fase crônica, o bloqueio do TNF-α com infliximab diminui o dano histopatológico em ratos infectados experimentalmente⁹. Alternativamente, altos níveis séricos de TNF-α têm se mostrado relacionados com a CC crônica¹⁵. Entretanto, outros autores demonstraram que o tratamento com etanercepte durante a fase crônica promove disfunção ventricular. Portanto, a controvérsia a respeito do papel do TNF-α na fisiopatologia da CC permanece não resolvida¹⁰. Complexos QRS de baixa tensão têm sido relacionados à miocardite aguda em pacientes com doença de Chagas¹⁶. Da mesma forma, nossos resultados sugerem que o bloqueio do TNF-α pode estar associado a uma deterioração da condução ventricular. Outro fato interessante é que os nossos resultados mostraram um aumento da taxa de sobrevivência no grupo tratado (Figura 1), sugerindo que as alterações no ECG não têm um valor preditivo durante a fase aguda. Portanto, embora piore os indicadores eletrocardiográficos de miocardite, o TNF-α aumenta as taxas de sobrevivência. Alguns autores relataram que a infecção aguda com linhagens Venezuelanas de tipo selvagem em um modelo de camundongo geraram uma resposta inflamatória generalizada, particularmente no sistema nervoso central¹⁷. Podemos supor que a inflamação sistêmica relacionada ao TNF-α desempenha um papel chave na mortalidade aguda em modelos experimentais. Os resultados obtidos pelo nosso grupo (resultados não publicados) indicam que o tratamento com etanercepte diminui a alodínia associada à inflamação visceral e melhora a condição geral de camundongos infectados com a mesma linhagem selvagem utilizada no presente estudo. Com base nesses resultados, podemos afirmar que a resposta regional ao TNF-α (no coração e nas vísceras abdominais) pode variar durante a fase aguda da infecção.

Por fim, nós observamos uma diminuição dos parâmetros de VFC dos animais tratados com etanercepte (Figura 3). A diminuição da VFC seria caracterizada pela disfunção autonômica e ventricular em pacientes com doença de Chagas¹⁸. Llaguno e cols.¹⁹ demonstraram disfunção autonômica em pacientes com doença de Chagas crônica e de alto risco cardiovascular, mas não conseguiram relacionar essa condição com os níveis séricos de citocinas¹⁹. Nossos resultados sugerem que o bloqueio do TNF-α induz uma disfunção autonômica durante a fase aguda da infecção em camundongos com doença de Chagas, e que a função cardiovascular piora após o tratamento. Por outro lado, Yu e cols.²⁰ relataram que a administração de etanercepte em cães submetidos a uma ligadura coronariana poderia diminuir a taquiarritmia ventricular e a necrose do miocárdio através de processos relacionados à dessensibilização β-adrenérgica mediada pela proteína quinase²⁰. Na doença de Chagas, no entanto, tem sido demonstrado que autoanticorpos dirigidos contra receptores adrenérgicos β₁ durante a fase aguda da infecção são capazes de ativar os canais de cálcio do tipo L, em um processo independente de dessensibilização^21,22. Além disso, Chung e cols.²³ demonstraram que citocinas liberadas pelas células inflamatórias inibem a estimulação adrenérgica causada por agonistas específicos, induzindo o acúmulo de AMPc devido à interrupção da sinalização através do sarcolema²³.

Como conclusão, esses resultados sugerem que, apesar da deterioração dos parâmetros ecocardiográficos, o bloqueio do TNF-α induz um aumento na sobrevida, abrindo uma discussão sobre a possibilidade de a mortalidade na infecção experimental estar relacionada a uma resposta inflamatória sistêmica induzida por TNF-α ao invés de piorar a função cardíaca. Outros estudos em diferentes modelos animais serão necessários para validar os resultados obtidos, principalmente no que diz respeito à taxa de sobrevivência, e descartar o fato de que a mortalidade ocorre principalmente por acaso e não pelos efeitos diretos do tratamento. Até onde sabemos, este é o primeiro relato que associa o bloqueio do TNF-α à miocardite caracterizada por alterações eletrocardiográficas e disfunção autonômica durante a fase aguda da infecção em camundongos com doença de Chagas experimental. No entanto, ainda não está claro se existe um equilíbrio frágil entre o controle da replicação do parasito e a preservação da função cardíaca. Esses resultados também ressaltam a necessidade de avaliar o possível papel terapêutico do bloqueio do TNF-α durante as fases aguda e crônica da infecção pelo T. cruzi.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Análise e interpretação dos dados: Rodríguez-Ângulo H, Mijares A; Obtenção de dados: Rodríguez-Ângulo H, García O, Castillo E, Cárdenas E; Análise estatística: Rodríguez-Ângulo H; Redação do manuscrito: Rodríguez-Ângulo H, Marques J, Mijares A; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Marques J, Mijares A.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Correspondência:

Alfredo Mijares

Carretera Panamericana, Km 11, Alto de Pipe

CEP 1020A, Caracas, Venezuela

E-mail:

amijares@ivic.gob.ve,

mijaresa@gmail.com

Artigo recebido em 10/11/12; revisado em 20/12/12; aceito em 21/02/13.

Abreviações

TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa

CC: Cardiomiopatia chagásica

TNFR: Receptor de TNF

VFC: Variabilidade da frequência cardíaca

ECG: Eletrocardiografia

SDNN: Desvio padrão dos intervalos R - R

IFN-γ: Interferon gama