FUNDAMENTO: O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF - vascular endothelial growth factor) induz a mobilização de células progenitoras endoteliais (CPEs) com capacidade de proliferação e diferenciação em células endoteliais, contribuindo, dessa forma, para o processo angiogênico. OBJETIVO: Buscamos avaliar o comportamento de CPEs em pacientes com doença cardíaca isquêmica e angina refratária que receberam injeções intramiocardicas de 2000 µg de VEGF165 como terapia única. MÉTODOS: O estudo foi uma subanálise de um ensaio clínico. Pacientes com doença cardíaca isquêmica avançada e angina refratária foram avaliados para inclusão no estudo. Os critérios de inclusão foram: sinais e sintomas de angina e/ou insuficiência cardíaca apesar de tratamento medicamentoso máximo e área de isquemia miocárdica de, no mínimo, 5% conforme avaliado por uma tomografia computadorizada por emissão de fóton único (TCEFU). Os critérios de exclusão foram: idade > 65 anos, fração de ejeção do ventrículo esquerdo < 25% e cancer diagnosticado. Os pacientes cujos níveis de CPE foram avaliados foram incluídos. A intervenção consistiu na administração de 2000 µg de VEGF 165 de plasmídeo injetado no miocárdio isquêmico. A frequência de células CD34+/KDR+ foi analisada por citometria de fluxo antes e 3, 9, e 27 dias após a intervenção. RESULTADOS: Um total de 9 pacientes foram incluídos, 8 homens, média de idade de 59,4 anos, fração de ejeção ventricular esquerda de 59,3%, e classe de angina predominante III. Observou-se um aumento significativo dos níveis de CPEs no terceiro dia após a intervenção. Todavia, 9 e 27 dias após a intervenção, os níveis de CPEs foram similares aos basais. CONCLUSÃO: Identificamos uma mobilização transitória de CPE, com pico no terceiro dia após a intervenção com VEGF 165 em pacientes com angina refratária. Todavia, os níveis de CPEs apresentaram-se semelhantes aos basais 9 e 27 dias após a intervenção.
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Angina refratária é caracterizada por desconforto torácico severo e persistente1,2 e é resistente aos tratamentos cardiológicos tradicionais, incluindo cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM), intervenção coronária percutânea (ICP) e terapia medicamentosa máxima1,2. Somente nos Estados Unidos, há aproximadamente 300.000 a 900.000 casos de angina refratária; além disso, são diagnosticados aproximadamente 25.000 a 75.000 pacientes novos a cada ano3. Neste contexto, terapia gênica, a qual possui potencial para promover a angiogênese miocárdica e a circulação colateral no miocárdio isquêmico, pode representar uma possível alternativa de tratamento para estes pacientes4.
O processo de angiogênese envolve a mobilização de células progenitoras endoteliais (CPEs), que são células multipotentes com a capacidade de se proliferar e diferenciar em células endoteliais maduras5. A terapia gênica usando o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 165 aparentemente promove a mobilização de CPEs6, mas pouco se sabe sobre o comportamento destas células em pacientes com angina refratária submetidos à terapia gênica com altas doses de VEGF 165.
A maioria dos estudos que utilizam VEGF 165 em pacientes com doença cardíaca isquêmica utilizaram outras intervenções conbinadas, como CRM e ICP7-10. No entanto, existe uma classe de pacientes que não são elegíveis para intervenções como essas; portanto, esses tratamentos combinados não são uma opção para eles1,2. Em situações como essas, a terapia gênica isolada pode ser uma solução, mas até hoje poucos estudos foram realizados, sendo que a maioria utiliza doses baixas de VEGF (125-250 µg)9,11,12. Portanto, o comportamento de CPEs em pacientes que recebem terapia gênica com doses altas de VEGF permanece incerto.
Este estudo teve o objetivo de avaliar o comportamento de CPEs em pacientes com doença cardíaca isquêmica e angina refratária que receberam uma injeção intramiocárdica de 2000 µg de VEGF165 como terapia única.
Trata-se de uma subanálise de um ensaio clínico (ClinicalTrial.gov NCT 00744315), o qual buscou avaliar a segurança, viabilidade e efeitos clínicos iniciais de administração transtorácica intramiocárdica de plasmídeo VEGF 165 em perfusão miocárdica em pacientes com doença arterial coronariana avançada e angina refratária que não foram qualificados para a revascularização percutânea ou cirúrgica. A justificativa e o delineamento deste ensaio clínico foram descritos anteriormente4. Este foi o primeiro ensaio clínico utilizando terapia gênica em pacientes com angina refratária na América Latina. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética local e todos os pacientes forneceram o consentimento livre e esclarecido prévio por escrito para participar.
Pacientes com doença cardíaca isquêmica avançada, não elegíveis à CRM e ICP, conforme avaliados por cirurgião e cardiologista intervencionista, foram considerados elegíveis para o estudo. Os critérios de inclusão foram: sinais e sintomas de angina e/ou insuficiência cardíaca apesar de tratamento medicamentoso máximo e uma área de isquemia miocárdica de, no mínimo, 5% conforme avaliado por uma tomografia computadorizada por emissão de fóton único (TCEFU). Os critérios de exclusão foram: idade > 65 anos, fração de ejeção do ventrículo esquerdo < 25% e diagnóstico de câncer. A subanálise incluiu somente pacientes cujos níveis de CPE foram avaliados durante o estudo.
Todos os pacientes foram submetidos a intervenção cirúrgica sob o efeito de anestesia geral em um centro especializado em cirurgia cardiovascular. O coração foi exposto por uma incisão de aproximadamente 5cm no 4º ou 5º espaço intercostal esquerdo de acordo com a área a ser tratada. Foi realizada pericardiotomia extensa, seguida de reparo para expor a face ventricular do miocárdio a ser tratada. Esta área havia sido previamente identificada por cintilografia tomográfica do miocárdio. Sob visão direta, 10 pontos do miocárdio isquêmico receberam um total de 2000µg do plasmideo com o gene, o qual foi diluido em um total de 5ml de solução salina, através de uma agulha butterfly 25F. Antes da toracorrafia, um dreno torácico foi colocado e mantido por 12 horas. A dor pós-operatória foi manejada com bloqueios intercostais e analgésicos injetáveis.
A estrutura do plasmídeo usado foi desenvolvida por um dos membros da nossa equipe Sang W. Han na Universidade Federal de São Paulo e produzida comercialmente pela Excellion Technology (Brasil, Petrópolis, RJ). A estrutura do plasmídeo de PEX-HV5 foi composta por íntron 1 de citomegalovírus (CMV) e seu promotor com sinais de splicing. O cDNA VEGF165 humano foi inserido entre o CMV, promotor e a sequência poliA bovina. Este vetor também continha origem pUC e sequências de resistência à canamicina para propagação em bactérias.
As CPEs foram analisadas utilizando citometria de fluxo antes e 3, 9 e 27 dias após a intervenção. As células mononucleares foram separadas do sangue periférico usando um gradiente de Ficoll (Ficoll-Paque, Invitrogen). A imunofenotipagem foi realizada pela coloração específica com anti-CD34 (BD Biosciences) e anti-KDR (BD Biosciences) conjugada ao fluoróforoisotiocianato de fluoresceína (FITC) e ficoeritrina (PE), respectivamente. As populações CD34+ e KDR+ foram analisadas no citômetro FACSCalibur utilizando o software CellQuest com a colaboração do Laboratório de Imunogenética no Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. A frequência de células CD34+/KDR+ foi analisada na barreira linfocitária na fração mononuclear do sangue periférico e 100.000 eventos foram contados. Os resultados mostram o número de células duplo-positivas (n/100.000 células).
As variáveis contínuas são expressas em médias e desvios padrões e as variáveis categóricas em frequências absolutas e relativas. O teste não paramétrico de Friedman foi usado para comparar a mesma variável em momentos diferentes em relação ao mesmo grupo. As análises foram realizadas usando o pacote estatístico SPSS 18.0.
Dos 13 pacientes incluídos no ensaio clínico primário, nove tiveram os níveis de CPEs avaliados e foram incluidos nesta subanálise. O fluxograma de pacientes do estudo é apresentado na
Dos nove pacientes, oito eram homens, média de idade de 58,4 ± 5,5 anos, média de fração de ejeção ventricular esquerda de 59,3 ± 8,8%, oito eram hipertensos e quatro diabéticos. A maioria dos pacientes apresentava angina classe III. Todos os pacientes haviam sido submetidos a ICP prévia, e sete deles à CRM, representando a gravidade da doença isquêmica destes pacientes (
Não houve mortes ou recorrências. A terapia demonstrou ser segura e viável nesta série de pacientes. Os resultados iniciais apresentaram uma redução na gravidade da angina e intensidade da isquemia miocárdica, conforme descrito anteriormente pelo nosso grupo4.
As análises de CPEs demonstraram um aumento nos níveis destas células no terceiro dia após a intervenção, quando comparado ao período basal (período basal, 42,7±19,2; dia 3, 66,6±34,3; p=0,03). No entanto, aos nove e 27 dias após a intervenção, os níveis de CPE apresentaram-se similares aos níveis basais (período basal, 42,7±19,2; dia 9, 34,9±15,0; p=NS) e (período basal, 42,7±19,2; dia 27, 36,1±12,9; p=NS) (
Este estudo foi o primeiro, de acordo com o nosso conhecimento, que avaliou a mobilização de CPEs em pacientes com cardiomiopatia isquêmica e angina refratária que foram submetidos à terapia gênica com 2000 µg de VEGF 165. Nossos resultados demonstraram uma mobilização transitória de CPEs, com um pico no terceiro dia após a terapia gênica.
Estudo anterior, o qual avaliou a mobilização de CPEs após terapia gênica, utilizou injeções de 250 µg de VEGF 165 intramiocárdica em 13 pacientes com isquemia miocárdica e relatou um pico de CPEs durante a primeira e quarta semanas após a intervenção. No entanto, além de utilizar uma dose substancialmente menor que a utilizada no nosso estudo, os resultados de citometria de fluxo foram obtidos com base em histogramas de 10.000 a 20.000 células por amostra. No nosso estudo, utilizamos o número de células duplo-positivas n/100.000, dificultando a comparação entre os estudos.
CPEs possuem a capacidade de mobilização e proliferação nas lesões vasculares, contribuindo para a neoangiogênese13. A mobilização de CPEs da medula óssea em resposta a diversos sinais tem sido bem descrita5. Estudos anteriores demonstraram a capacidade do VEGF de promover a mobilização e diferenciação de CPE
A pequena amostra de pacientes pode ser considerada uma limitação do estudo; no entanto, este tamanho de amostra é resultado de um ensaio clínico de fase I/II4 para testar a segurança e viabilidade de 2000 µg de VEGF 165 como terapia única para doença cardíaca isquêmica com angina refratária. Estes estudos visam testar a segurança e viabilidade do procedimento e fornecer resultados clínicos iniciais, e normalmente incluem amostras pequenas de pacientes por motivos de segurança. Contudo, este estudo contribui para do comportamento de CPE e do processo angiogênico após a terapia gênica com altas doses de VEGF 165. Dessa forma, as informações obtidas neste estudo podem ser usadas como justificativa para futuros ensaios clínicos de fase II ou III.
Identificamos uma mobilização transitória de CPEs, com pico no terceiro dia a intervenção, e retorno aos níveis basais aos nove e 27 dias após terapia gênica com 2000 µg de VEGF 165 em pacientes com angina refratária.
Abdala Karam Kalil Av. Princesa Isabel, 370, Santana CEP 90620-000, Porto Alegre, RS - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 29/10/12; revisado em 29/10/12; aceito em 14/03/13
BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces mobilization of endothelial progenitor cells (EPCs) with the capacity for proliferation and differentiation into mature endothelial cells, thus contributing to the angiogenic process. OBJECTIVE: We sought to assess the behavior of EPCs in patients with ischemic heart disease and refractory angina who received an intramyocardial injections of 2000 µg of VEGF 165 as the sole therapy. METHODS: The study was a subanalysis of a clinical trial. Patients with advanced ischemic heart disease and refractory angina were assessed for eligibility. Inclusion criteria were as follows: signs and symptoms of angina and/or heart failure despite maximum medical treatment and a myocardial ischemic area of at least 5% as assessed by single-photon emission computed tomography (SPECT). Exclusion criteria were as follows: age > 65 years, left ventricular ejection fraction < 25%, and a diagnosis of cancer. Patients whose EPC levels were assessed were included. The intervention was 2000 µg of VEGF 165 plasmid injected into the ischemic myocardium. The frequency of CD34+/KDR+ cells was analyzed by flow cytometry before and 3, 9, and 27 days after the intervention. RESULTS: A total of 9 patients were included, 8 males, mean age 59.4 years, mean left ventricular ejection fraction of 59.3% and predominant class III angina. The number of EPCs on day 3 was significantly higher than that at baseline (p = 0.03); however, that on days 9 and 27 was comparable to that at baseline. CONCLUSION: We identified a transient mobilization of EPCs, which peaked on the 3th day after VEGF 165 gene therapy in patients with refractory angina and returned to near baseline levels on days 9 and 27.
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Refractory angina is characterized by severe and persistent cardiac discomfort1,2 and is resistant to traditional cardiological treatments, including coronary artery bypass grafting (CABG), percutaneous coronary intervention (PCI), and maximum drug therapy1,2. In the United States alone, there are approximately 300,000 to 900,000 cases of refractory angina; in addition, about 25,000 to 75,000 new patients are diagnosed each year3. Gene therapy, which has the potential to promote myocardial angiogenesis and collateral circulation in ischemic myocardium, may represent a possible treatment modality for these patients4.
Angiogenesis involves the mobilization of endothelial progenitor cells (EPCs), which are multipotent cells with the capacity to proliferate and differentiate into mature endothelial cells5. Gene therapy using vascular endothelial growth factor (VEGF) 165 appears to promote the mobilization of EPCs6, but very little is known about the behavior of such cells in patients with refractory angina who have undergone gene therapy with high doses of VEGF 165.
Most studies using VEGF 165 in patients with ischemic heart disease have been conducted in combination with other interventions such as CABG and PCI7-10. However, a class of patients exists who are not eligible for such interventions; therefore, these combined treatments are not an option for them1,2. In such situations, gene therapy alone may be a possible solution, but till date, only a few studies have been conducted, with most of them using low doses of VEGF (125-250 µg)9,11,12. Therefore, the behavior of EPCs in patients receiving gene therapy with high doses of VEGF remains unclear.
The present study aimed to assess the behavior of EPCs in patients with ischemic heart disease and refractory angina who received an intramyocardial injection of 2000 µg of VEGF 165 as the sole therapy.
This was a subanalysis of a trial registered as ClinicalTrial.gov NCT 007443154, which aimed to evaluate the safety, feasibility, and initial clinical effects of intramyocardial transthoracic administration of plasmid VEGF 165 on myocardial perfusion in patients with advanced coronary artery disease and refractory angina who did not qualify for percutaneous or surgical revascularization. The rationale and design of this trial have been described previously4. This was the first clinical trial that used gene therapy for patients with refractory angina in Latin America. The protocol was approved by the local Ethics Committee, and all patients provided written informed consent prior to participation.
Patients with advanced ischemic heart disease who were contraindicated for CABG or PCI as assessed by a cardiovascular surgeon and interventional cardiologist were eligible for enrollment. Inclusion criteria were as follows: signs and symptoms of angina and/or heart failure despite maximum medical treatment and a myocardial ischemic area of at least 5% as assessed by single-photon emission computed tomography (SPECT). Exclusion criteria were as follows: age > 65 years, left ventricular ejection fraction < 25%, and a cancer diagnosed. The subanalysis included only those patients whose EPC levels were assessed during the study.
All patients were submitted to surgical intervention under general anesthesia at a center specializing in cardiovascular surgery. The heart was exposed by an incision of approximately 5 cm at the 4th or 5th left intercostal space according to the area to be treated. An extensive pericardiotomy was placed and was followed by pericardial repair. The area to receive the plasmid vector solution injection was identified by preoperative myocardial SPECT. Under direct vision, 10 points of the ischemic myocardium received a total of 2000 µg of gene VEGF 165 plasmid, which was diluted in a total of 5 ml of saline solution, via a 25F butterfly injection needle. Prior to thoracography, a thoracic tube was placed and maintained for 12 h. Postoperative pain was managed using intercostal block and injectable analgesics.
The plasmid backbone used was developed by one of our team members Sang W. Han at the Federal University of São Paulo and produced commercially by Excellion Technology (Brazil, Petropolis, RJ). The plasmid backbone of PEX-HV5 was composed of cytomegalovirus (CMV) intron 1 and its promoter with splicing signals. The human VEGF165 cDNA was inserted between the CMV promoter and the bovine polyA sequence. This vector also contained a pUC origin and kanamycin resistance sequences for propagation in bacteria.
EPCs were analyzed using flow cytometry before and 3, 9, and 27 days after intervention. Mononuclear cells were separated from the peripheral blood using a Ficoll gradient (Ficoll-Paque, Invitrogen). Immunophenotyping was performed by specific staining with anti-CD34 (BD Biosciences) and anti-KDR (BD Biosciences) conjugated to the fluorophores fluorescein isothiocyanate (FITC) and phycoerythrin (PE), respectively. The CD34+ and KDR+ populations were analyzed in the FACSCalibur cytometer using CellQuest software in collaboration with the Laboratory of Immunogenetics at the Department of Genetics, Federal University of Rio Grande do Sul. The frequency of CD34+/KDR+ cells was analyzed in the lymphocyte gate in the peripheral blood mononuclear fraction and 100,000 events were counted. The results show the number of double-positive cells (n/100.000 cells).
Continuous variables are expressed as means and standard deviations and categorical variables as absolute and relative frequencies. The Friedman nonparametric test was used to compare the same variable at different times. Analyses were performed using the SPSS 18.0 statistical package.
Of the 13 patients enrolled in the primary trial, 9 (8 males; mean age, 58.4 ± 5.5 years; mean left ventricular ejection fraction, 59.3% ± 8.8%) underwent assessment of EPCs and were included in the subanalysis. the patients workflow of the study is demonstrated in
Eight patients were hypertensive and 4 had diabetes. A majority of patients suffered from class III angina. All patients had previously undergone PCI, and 7 of them had also undergone CABG. These findings indicated the severity of ischemic disease in these patients (
There were no deaths or recurrences. The therapy was demonstrated to be safe and feasible in this series of patients. Initial results showed a decrease in the severity of angina and intensity of myocardial ischemia, as previously described by our group4.
Analyses of EPCs demonstrated an increase in the number of cells on the 3th day after intervention compared to baseline (baseline, 42.7 ± 19.2; day 3, 66.6 ± 34.3; p = 0.03). However, the number of EPCs decreased to become comparable to baseline on days 9 and 27 (baseline, 42.7 ± 19.2; day 9, 34.9 ± 15.0; baseline, 42.7 ± 19.2; day 27, 36.1 ± 12.9; p = NS for both;
This study was the first, as per our knowledge, that assessed the mobilization of EPCs in patients with ischemic heart disease and refractory angina who underwent gene therapy with 2000 µg of VEGF 165. Our results showed a transient mobilization of EPCs, with peak on the 3th day after gene therapy.
A previous study evaluating mobilization of EPCs after gene therapy6 administered 250 µg of intramyocardial VEGF 165 to 13 patients with myocardial ischemia and reported a peak of EPCs during week 1 and week 4 after the intervention. However, besides using a substantially smaller dose of VEGF, their results of flow cytometry were obtained based on histograms of 10,000 to 20,000 cells per sample, while we used the number of double-positive n/100.000 cells. Thus, making difficult the comparison between the trials.
EPCs have the ability to home in vascular injury sites and contribute to neoangiogenesis13. Mobilization of EPCs from the bone marrow in response to different signals has also been well described5. Previous studies have demonstrated the ability of VEGF to promote EPC mobilization
The small sample of patients may be thought to limit the power of the study; however, this sample size is derived from a phase I/II clinical trial4 to test the safety and feasibility of 2000 µg of VEGF 165 as the sole therapy for ischemic heart disease with refractory angina. Such studies aim to test the safety and feasibility of the procedure and provide initial clinical results, and they usually include small sample of patients for safety reasons. This study contributes to the understanding of EPC behavior and the myocardial angiogenic process after gene therapy with high doses of VEGF 165. Information obtained from this study can thus be used as a rationale for future phase II or III clinical trials.
We identified a transient mobilization of EPCs, which peaked on the 3th day and returned to baseline levels on the 9th and 27th days after gene therapy with 2000 µg of VEGF 165 in patients with refractory angina.