abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil RDHNKfvjhGsFScrbj4gqczt S0066-782X2013002700010 S0066-782X(13)10100100010 10.5935/abc.20130110 Artigos Originais Quantificação da área de infarto usando-se SPECT de perfusão miocárdica de alta resolução em ratos Oliveira Luciano Fonseca Lemos de Mejia Jorge Carvalho Eduardo Elias Vieira de Lataro Renata Maria Frassetto Sarita Nasbine Fazan Jr Rubens Salgado Hélio Cesar Galvis-Alonso Orfa Yineth Simões Marcus Vinícius Ribeirão Preto São Paulo Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Departamento de Clínica Médica Brazil Ribeirão Preto São Paulo Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Departamento de Fisiologia Brazil São José do Rio Preto São Paulo Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto Departamento de Biologia Molecular Brazil 07 2013 101 1 59 67 01 09 2012 06 03 2013 17 09 2012 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: Técnicas de imageamento in vivo permitem avaliar sequencialmente a morfologia e a função dos órgãos em diversos modelos experimentais. Desenvolvemos um dispositivo de adaptação de uma gama-câmara clínica para obter imagens tomográficas por emissão de fótons singulares (SPECT) de alta resolução, baseado em colimador pinhole. OBJETIVO: Determinar a acurácia desse sistema na quantificação da área de infarto miocárdico em ratos. MÉTODOS: Treze ratos Wistar machos (250 g) foram submetidos a infarto do miocárdio por oclusão da artéria coronária esquerda. Após 4 semanas, foram adquiridas imagens tomográficas com o sistema desenvolvido, 1,5 hora após a injeção endovenosa de 555MBq de 99mTc-Sestamibi. Na reconstrução tomográfica, utilizamos software especialmente desenvolvido baseado no algoritmo de Máxima Verossimilhança. Comparamos as médias e analisamos a correlação entre a extensão dos defeitos perfusionais detectados pela cintilografia e a extensão da fibrose miocárdica avaliada pela histologia. RESULTADOS: As imagens apresentaram ótima relação órgão-alvo/fundo, com apropriada visualização das paredes e da cavidade do ventrículo esquerdo. Todos os animais exibindo áreas de infarto foram corretamente identificados pelas imagens de perfusão. Não houve diferença entre a área do infarto medida pelo SPECT (21,1 ± 21,2%) e pela histologia (21,7 ± 22,0%; p = 0,45), obtendo forte correlação entre os valores da área de infarto mensurada pelos dois métodos (r = 0,99; p < 0,0001). CONCLUSÃO: O sistema desenvolvido apresentou resolução espacial adequada e elevada acurácia para detecção e quantificação das áreas de infarto miocárdico, sendo uma opção de baixo custo e grande versatilidade na obtenção de imagens em SPECT de alta resolução de órgãos de pequenos roedores.

 Infarto do Miocárdio Ratos Tomografia Computadorizada de Emissão Epidemiologia Experimental 31 07 2013

ARTIGO ORIGINAL

Quantificação da área de infarto usando-se SPECT de perfusão miocárdica de alta resolução em ratos

Luciano Fonseca Lemos de OliveiraI; Jorge MejiaII; Eduardo Elias Vieira de CarvalhoI; Renata Maria LataroI; Sarita Nasbine FrassettoI; Rubens Fazan JrIII; Hélio Cesar SalgadoIII; Orfa Yineth Galvis-AlonsoII; Marcus Vinícius SimõesI

IDivisão de Cardiologia, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP

IIDepartamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, São José do Rio Preto, SP

IIIDepartamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: Técnicas de imageamento in vivo permitem avaliar sequencialmente a morfologia e a função dos órgãos em diversos modelos experimentais. Desenvolvemos um dispositivo de adaptação de uma gama-câmara clínica para obter imagens tomográficas por emissão de fótons singulares (SPECT) de alta resolução, baseado em colimador pinhole.

OBJETIVO: Determinar a acurácia desse sistema na quantificação da área de infarto miocárdico em ratos.

MÉTODOS: Treze ratos Wistar machos (250 g) foram submetidos a infarto do miocárdio por oclusão da artéria coronária esquerda. Após 4 semanas, foram adquiridas imagens tomográficas com o sistema desenvolvido, 1,5 hora após a injeção endovenosa de 555MBq de 99mTc-Sestamibi. Na reconstrução tomográfica, utilizamos software especialmente desenvolvido baseado no algoritmo de Máxima Verossimilhança. Comparamos as médias e analisamos a correlação entre a extensão dos defeitos perfusionais detectados pela cintilografia e a extensão da fibrose miocárdica avaliada pela histologia.

RESULTADOS: As imagens apresentaram ótima relação órgão-alvo/fundo, com apropriada visualização das paredes e da cavidade do ventrículo esquerdo. Todos os animais exibindo áreas de infarto foram corretamente identificados pelas imagens de perfusão. Não houve diferença entre a área do infarto medida pelo SPECT (21,1 ± 21,2%) e pela histologia (21,7 ± 22,0%; p = 0,45), obtendo forte correlação entre os valores da área de infarto mensurada pelos dois métodos (r = 0,99; p < 0,0001).

CONCLUSÃO: O sistema desenvolvido apresentou resolução espacial adequada e elevada acurácia para detecção e quantificação das áreas de infarto miocárdico, sendo uma opção de baixo custo e grande versatilidade na obtenção de imagens em SPECT de alta resolução de órgãos de pequenos roedores.

Palavras-chave: Infarto do Miocárdio, Ratos, Tomografia Computadorizada de Emissão, Epidemiologia Experimental.

Introdução

Nas últimas décadas, animais de laboratório tornaram-se importante ferramenta em pesquisas pré-clínicas1. Em cardiologia, pequenos animais têm sido usados com sucesso para reprodução de diversos modelos de cardiopatias e seus resultados têm permitido o estudo de novas drogas, assim como os estudos dos mecanismos fisiopatológicos de doenças cardíacas2-5.

Na exploração desses modelos animais, apesar de muitas variáveis experimentais poderem ser avaliadas in vivo, na maioria dos casos o animal deve ser sacrificado e o órgão de interesse deve ser excisado e processado para obtenção dos resultados. Esse processo elimina a possibilidade de avaliações múltiplas ao longo do tempo. Entretanto, o desenvolvimento recente de técnicas para a aquisição de imagens in vivo em pequenos animais passou a permitir a avaliação sequencial da estrutura e da função de órgãos de forma não invasiva, com economia de tempo, número de animais e redução de custos.

Os equipamentos de uso clínico, baseados na ultrassonografia e na ressonância nuclear magnética, exibem sensibilidade e resolução espacial suficientes para obtenção de imagens de órgãos de pequenos animais, que são, em média, 10 a 30 vezes menores em dimensões lineares do que os órgãos de seres humanos. Contudo, os equipamentos clínicos convencionais utilizados para obtenção de imagens cintilográficas tomográficas por emissão de fótons singulares (SPECT) fornecem uma resolução espacial em torno de 6 mm, não apropriada para órgãos de pequenos animais, cuja resolução espacial necessária é em torno de 1 mm.

Nosso grupo de pesquisa recentemente descreveu a implementação de um sistema de aquisição de imagens de SPECT de alta resolução baseado em um colimador pinhole (único orifício), um sistema rotacional de suporte do pequeno animal e ferramentas de software apropriadas adaptadas a uma gama-câmara de uso clínico6,7. O objetivo do presente estudo foi validar esse sistema para quantificação in vivo da área de fibrose miocárdica em modelo experimental de infarto em ratos, tendo como padrão-ouro a medida in vitro da área de infarto pelo estudo histopatológico.

Métodos

Construção e adaptação do sistema de aquisição de imagens tomográficas

Uma gama-câmara clínica (DST/Sopha Medical Vision, Twinsburg, Ohio, USA) foi adaptada pela construção de um sistema de blindagem que permitiu a fixação de um colimador de orifício simples, com diâmetro de 1,5 mm e ângulo de abertura total de 150º. Essa blindagem teve um formato de tronco de pirâmide recoberta com uma manta de chumbo de 6 mm de espessura, adequada para fótons com energia na faixa de 150 keV. Adicionalmente, foi desenvolvido um suporte cilíndrico para o posicionamento do animal. Esse suporte é acoplado a um sistema motorizado, que permitiu rotacionar o alvo para as diferentes posições angulares, de acordo com o número de projeções a serem registradas ao longo dos 360ºda aquisição tomográfica. Sincronizada com o protocolo de aquisição dinâmico da gama-câmara, a sequência de projeções foi registrada e armazenada em formato DICOM. Na Figura 1, ilustramos o conjunto do hardware construído.

Implementação do software de reconstrução

Após a aquisição das projeções, as imagens gravadas foram exportadas em formato DICOM para um computador pessoal, no qual foram processadas para obtenção do modelo tridimensional da distribuição do radiofármaco no alvo7. Para isso, desenvolvemos um software de reconstruções iterativas de imagens, baseado no algoritmo de Máxima Verossimilhança8. Os detalhes matemáticos dos cálculo de reconstrução iterativa podem ser consultados em publicação anterior7. Ainda que a reconstrução iterativa seja mais lenta do que o algoritmo clássico de retroprojeção filtrada, ela produz imagens de melhor qualidade, em termos de relação sinal-ruído e resolução espacial, e permite uma melhor modelagem do processo físico envolvido durante a aquisição das imagens9,10. A ferramenta foi implementada em Linguagem C, usando um compilador freeware Dev-C++ (Bloodshed Software). Para visualização final das reconstruções, foi utilizado o freeware Amide Medical Image Data Examiner11.

Imagens de fantoma

A fim de verificar a resolução espacial tomográfica alcançada pelo sistema, foram adquiridas imagens de um fantoma de barras quentes. Esse fantoma consiste de quatro conjuntos de espaços cilíndricos de diferentes diâmetros (1, 2, 3 e 4 mm), preenchidos com pertecnetato de sódio, sendo a distância entre eles igual ao dobro do seu diâmetro (Figura 2A). Na aquisição das imagens do fantoma, foram utilizados os mesmos parâmetros empregados para a aquisição de imagens dos animais experimentais.

Animais experimentais

Após aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal de nossa instituição , os experimentos foram realizados com 15 ratos Wistar machos com peso inicial de 250g. Os animais foram fornecidos pelo biotério central da mesma instituição, mantidos em alojamento climatizado, com acesso livre a água e ração padrão, submetidos a ritmo de 12 horas de luz/sombra e temperatura controlada. Em todos os procedimentos, máximo esforço foi feito para evitar o sofrimento desnecessário nos animais.

Indução do infarto do miocárdio experimental

O infarto miocárdico experimental foi induzido em 13 animais pelo método descrito por Pfeffer e cols.12, com ligeiras modificações. Dois animais foram mantidos como controles não infartados. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia k etamina (50 mg/kg, i.m., União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brasil) e xilazina (10 mg/kg, i.m., HertapeCalier Saúde Animal S/A, Juatuba, MG, Brasil) e intubação orotraqueal para ventilação mecânica (Advanced Safety Ventilator, Harvard Apparatus, MA1 55-7059, Holliston, MA, USA). Assim, o coração foi exposto por uma incisão no terceiro espaço intercostal esquerdo, e o ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda foi identificado e ligado com um fio de poliéster (4-0, Ethicon, São José dos Campos, SP, Brasil). Em seguida, o tórax foi fechado e os animais levados para recuperação no Biotério do Departamento de Fisiologia de nossa instituição .

Aquisição de imagens de perfusão miocárdica

Os animais foram submetidos aos exames de imagem 4 semanas após a indução do infarto miocárdico experimental. Para o protocolo de imagens, os animais foram anestesiados com uma combinação de ketamina e xilazina (50 e 5 mg/kg, respectivamente). Uma atividade de 555 MBq de 99mTc-Sestamibi foi injetada na veia da cauda. Uma hora e meia após a injeção, os animais foram novamente anestesiados com ketamina e xilazina (75 e 7,5 mg/kg, respectivamente) e posicionados no sistema para a aquisição de imagens.

Trinta e seis projeções, igualmente espaçadas em 360º, foram adquiridas em todos os protocolos de imagens. As projeções foram registradas em uma matriz de 128 x 128 elementos, cada elemento com uma área de 3,4 mm x 3,4mm. Um fator de magnificação de 6,3X foi adotado para todos os experimentos, o que corresponde a uma dimensão lateral de elemento do volume do objeto (ou voxel) de 0,54 mm. O tempo de aquisição por projeção foi de 30 segundos, totalizando aproximadamente 21 minutos por animal.

Não se registrou mortalidade associada à realização dessas imagens na janela temporal de 4 semanas após infarto.

Processamento e análise das imagens de perfusão miocárdica

Após a reconstrução das imagens de SPECT utilizando-se algoritmo de reconstrução iterativa, a imagem foi apropriadamente rotacionada e foram selecionados cortes tomográficos dos eixos curto, longo vertical e longo horizontal. As imagens foram normalizadas para o pixel miocárdico de máximo valor de captação dentro do volume e submetidas à análise visual.

Para quantificação do defeito perfusional nas imagens de SPECT, foram utilizados quatro cortes tomográficos do eixo curto em diferentes níveis da cavidade ventricular esquerda: um corte apical, dois cortes médio-ventriculares e um corte basal. Utilizando o freeware de processamento de imagens ImageJ, foi determinado perfil de intensidade ao longo da circunferência do miocárdio do ventrículo esquerdo (VE). As áreas de defeito perfusional foram identificadas pela presença de pixels com valores de captação abaixo de 50% em relação ao pixel de máximo acúmulo de captação no miocárdio. A extensão total do defeito perfusional miocárdico foi expresso como percentual de área do VE, sendo calculada pela razão do número total dos pixels com captação menor que 50% (obtidos nos quatro cortes) pelo número total de pixels compondo o perfil circunferencial do VE nos quatro cortes tomográficos analisados, sendo esse resultado multiplicado por cem.

Um único investigador, velado quanto aos resultados da análise histológica, foi responsável pelo processamento quantitativo das imagens.

Histologia

Para análise histopatológica após a eutanásia, o coração foi rapidamente excisado e fixado em formaldeído a 10%, por 24 horas, e, depois, transferido para álcool 70%. As amostras foram progressivamente desidratadas e embebidas em parafina. Cortes histológicos foram produzidos seguindo-se plano de corte perpendicular ao longo eixo do coração, de forma a reproduzir os cortes em eixo curto obtidos nos estudos de perfusão miocárdica in vivo. Esses cortes foram corados com tricrômico de Masson para perfeita identificação das áreas de fibrose, que ficam coradas em azul.

Para quantificação da área de fibrose nos estudos histológicos, procedeu-se de forma semelhante ao descrito para os cortes tomográficos dos estudos de perfusão in vivo. Resumidamente, as imagens correspondentes aos quatro níveis de corte da cavidade ventricular esquerda foram digitalizadas mediante emprego de um escâner. Um perfil circunferencial acompanhando a conformação das paredes do VE foi delineado utilizando-se o programa ImageJ, sendo computada a extensão linear da circunferência do VE em cada corte. Também foi identificada e quantificada, em cada corte, a extensão linear do tecido miocárdico corado como fibrose. A extensão da fibrose miocárdica, expressa em percentual da área da superfície do VE foi calculada pela divisão da extensão total do tecido fibrótico nos quatro cortes, dividida pela extensão total das circunferências do VE em todos os quatro cortes, sendo o valor final multiplicado por cem.

Um único investigador realizou a quantificação das áreas de fibrose nos estudos histológicos, estando velado quanto aos resultados obtidos nas imagens in vivo.

Análise estatística

Os resultados foram expressos na forma de média e desvio padrão da média. A distribuição Gaussiana das variáveis foi verificada mediante emprego do teste de Kolmogorov-Smirnov. Para comparação entre os valores médios da extensão da fibrose miocárdica entre o método in vivo e a histologia, foi utilizado o teste t de Student pareado. Para análise de correlação entre os resultados individuais obtidos em cada um dos métodos, foi utilizado o teste de regressão linear e correlação pelo método dos mínimos quadrados. O método gráfico de Bland-Altman foi utilizado para análise adicional da concordância entre as medidas da área de fibrose obtidas pelos dois métodos empregados.

Resultados

Resolução espacial das imagens tomográficas

A Figura 2B mostra imagens tomográficas reconstruídas dos cortes transversais, em secção perpendicular ao longo eixo, das barras preenchidas com radioatividade do fantoma micro-Jasczak. Numa análise visual semiquantitativa, é possível identificar-se, com nitidez, o contorno das barras do grupo com diâmetro internos de 2 mm, perdendo-se a resolução das imagens no grupo de barras com diâmetro interno de 1 mm, sugerindo que o limite da resolução espacial se encontre entre os valores de 1 e 2 mm. Uma determinação mais precisa da resolução espacial foi obtida pela análise de um perfil de contagens de uma fonte linear (PSF), que resultou em uma resolução espacial de 1,5 mm (largura à meia altura). O tamanho do pixel no objeto imageado foi de 0,6 mm.

Análise visual das imagens de perfusão miocárdica

A Figura 3 apresenta imagens do SPECT de perfusão miocárdica de um dos animais controles, utilizados para padronização inicial da visualização das imagens. Observou-se elevada relação de contagens órgão-alvo/fundo com nitidez os limites das paredes e o delineamento da cavidade do VE, além da visualização das paredes do ventrículo direito em alguns cortes médio-cavitários. As imagens do animal controle apresentam distribuição uniforme do radiotraçador entre os diferentes seguimentos miocárdicos, com exceção do ápice que apresentou uma menor intensidade de captação, que foi atribuída ao afilamento parietal da região apical. Entretanto, esses valores não estiveram abaixo de 50% em relação ao pixel de máximo acúmulo de captação no miocárdio.

A qualidade das imagens dos animais infartados (Figura 4) é comparável com a dos animais controles; além disso, evidenciou-se claramente o defeito de captação em territórios compatíveis com áreas de irrigação da artéria coronária esquerda do rato (parede anterior, anterolateral e região apical) em todos os animais, com áreas significativas de infarto confirmadas na histologia.

Análise quantitativa das áreas de infarto miocárdico

Na Figura 5, podemos comparar as imagens tomográficas do SPECT de perfusão miocárdica dos cortes com as imagens correspondentes do estudo histológico, usadas para quantificação do defeito perfusional e área de fibrose, respectivamente. Nota-se grande semelhança da morfologia das paredes assim como a topografia e a extensão do defeito perfusional miocárdico mostrado nas imagens de SPECT e nos cortes histológicos.

A área de infarto miocárdico quantificada pela histologia foi de 21,7 ± 22,0% da superfície do VE. O tamanho da área de infarto miocárdico apresentou grande variação individual entre os animais, com extremos de 26,5 a 55,0%, sendo que seis animais não apresentaram área significativa de fibrose no estudo histopatológico.

Todos os animais exibindo áreas significativas de fibrose miocárdica no estudo histológico foram corretamente identificados pela presença de defeitos de captação no SPECT de perfusão miocárdica. A área da superfície do VE exibindo defeito de captação detectado no SPECT de perfusão miocárdica (área de infarto) foi 21,1 ± 21,2% (extremos de 30,0 a 50,0%), resultados estes semelhantes ao obtido no estudo histológico (p=0,45).

Mediante análise de regressão linear, obteve-se excelente correlação entre os valores individuais da extensão do defeito de captação miocárdica pelo SPECT e a extensão da fibrose miocárdica pela histologia (n = 13, r = 0,99; p < 0,0001). Observa-se, no gráfico de dispersão, que a linha de regressão exibe um slope = 1,03, mostrando-se quase superponível à reta de identidade entre os resultados (Figura 6).

A plotagem dos dados seguindo-se o método gráfico de análise de concordância entre medidas de Bland-Altman (Figura 7) mostrou elevada concordância entre os resultados obtidos pelos dois métodos. Como se observa no gráfico, a média das diferenças entre as medidas foi de -0,6, valor muito próximo ao zero (valor ideal). Os valores individuais das diferenças entre as medidas distribuem-se em estreita faixa em torno da média, situando-se entre as barras representativas de 2 desvios padrão, demonstrando que o limite de variação para a diferença entre as medidas foi bastante aceitável (±5,4 pontos percentuais).

Discussão

Neste estudo, descrevemos um sistema para obtenção de imagens cintilográficas em SPECT de alta resolução para pequenos animais, baseado num colimador pinhole acoplado a um suporte rotacional, adaptados a uma gama-câmara clínica. No melhor do nosso conhecimento, este é o primeiro dispositivo dessa natureza desenvolvido na América Latina. O desempenho desse sistema permitiu identificar estruturas entre 1 e 2 mm, atingindo uma resolução espacial de 1,5 mm (FWHM) com um tamanho de pixel de 0,6 mm. Esses valores são semelhantes aos reportados em outros estudos, descrevendo sistemas adaptados em gama-câmara clínica13-15 e sistemas especialmente construídos para pequenos animais16-18.

Além de elevada resolução espacial, as imagens de SPECT de perfusão miocárdica obtidas dos animais, tanto controles quanto infartados, apresentaram qualidade comparáveis às das imagens obtidas em humanos, com visualização apropriada das paredes e da cavidade ventricular esquerda, além da visualização da parede do ventrículo direito em alguns cortes, com elevada relação de contagens órgão-alvo/fundo.

Quando comparadas ao histopatológico, as imagens de SPECT de perfusão miocárdica dos animais submetidos ao infarto experimental apresentaram grande semelhança na morfologia das paredes, assim como na topografia da área de infarto. Adicionalmente, a extensão do defeito perfusional miocárdico apresentou uma forte correlação com a área de infarto medido pela histologia. Nossos resultados, em relação à acurácia na quantificação da extensão da área de infarto, são comparáveis àqueles relatados por outros estudos utilizando ratos e camundongos em outros sistemas de imagens cintilográficas de alta resolução13,14,18-20. Esses aspectos sugerem, no conjunto, que o sistema desenvolvido tem desempenho e acurácia comparáveis aos de sistemas dedicados comercialmente disponíveis.

Um sistema de aquisição de arquitetura aberta, como o descrito aqui, mostra-se bastante versátil, pois, além de ser facilmente acoplado a outras gama-câmaras, pequenas mudanças em sua configuração permitem a realização de imagens de animais de diferentes tamanhos, variando de 30 a 800 g. Essas mudanças consistem na substituição do suporte rotacional por outros de diferentes calibres e no ajuste da distância entre o animal a ser estudado e o orifício do pinhole, promovendo diferentes magnificações do objeto imageado. Essa versatilidade permite ainda ajustes para otimização dos parâmetros de aquisição de diferentes modalidades de estudos cintilográficos cardíacos no mesmo animal (por exemplo: ventriculografia nuclear planar e tomográfica e gated-SPECT de perfusão) e possibilidade de imagens funcionais de diferentes órgãos (por exemplo: cérebro, rim, tireoide e pulmão). Além disso, quando comparado a sistemas dedicados a pequenos animais comercialmente disponíveis para obtenção de imagens de SPECT, o sistema descrito aqui exibe custos de construção incomparavelmente menores. O investimento em material e mão de obra especializada empregados para a montagem física do sistema descrito aqui foi de aproximadamente R$10.000,00. O desenvolvimento do software de reconstrução empregou plataformas de acesso livre e os algoritmos e fórmulas matemáticas que fundamentam o programa foram publicados anteriormente7.

Alguns aspectos técnicos adicionais devem ser apresentados para se explicarem as vantagens da configuração desse tipo de sistema de aquisição de imagens, em que o alvo (pequeno animal) é girado em frente ao detector. Imagens de SPECT são baseadas na aquisição de um conjunto de imagens planares (projeções) em diferentes ângulos ao redor do objeto. No cenário clínico, as projeções geralmente são obtidas por colimadores paralelos, sendo que a cabeça do detector gira em órbita circunferencial em torno do paciente, resultando em imagens com uma resolução espacial de aproximadamente 6 mm (largura à meia altura)21. Para imagens de órgãos de pequenos animais, é tecnicamente mais vantajoso girarmos o animal, para obtenção das projeções, e não o detector. Dessa forma, a maioria dos desalinhamentos e oscilações causadas pela movimentação da cabeça do detector da gama-câmara são eliminados, bem como são minimizados o custo de construção e o espaço de operação do sistema.

Diferentemente do que acontece quando se empregam colimadores de orifícios paralelos, há um fator de magnificação implícito no uso do colimador pinhole. Essa magnificação é uma função da relação das distâncias entre o detector e o colimador e entre o objeto-alvo e o colimador. Quanto mais próximo do orifício do pinhole, maior o fator de magnificação do objeto a ser estudado. Também é importante ressaltar que a sensibilidade do sistema (velocidade de acúmulo de contagens) é uma função da área do orifício do colimador. No nosso equipamento, é possível a utilização de diferentes diâmetros de orifício (de 0,5 a 2 mm), feitos de chumbo ou ouro, assim como colimadores com múltiplos orifícios, o que pode otimizar o processo de aquisição das imagens cintilográficas.

Vários argumentos podem ser elencados para salientar a importância da obtenção de imagens de perfusão miocárdica de alta resolução em modelos experimentais de cardiopatia isquêmica e de isquemia/reperfusão. A indução de infarto miocárdico é o modelo de insuficiência cardíaca/disfunção ventricular esquerda mais frequentemente empregado na pesquisa pré-clínica22. A quantificação precisa da extensão da fibrose por métodos de imagem in vivo podem representar auxílio relevante na caracterização desses modelos, permitindo a seleção de animais mais homogêneos em relação ao tamanho do infarto, bem como aquilatar, de forma longitudinal, o efeito de terapias anti-isquêmicas e estratégias de reperfusão miocárdica, assemelhando-se ao que foi descrito nos estudos clínicos empregando o SPECT de perfusão miocárdica23.

Por outro lado, a avaliação sequencial do tamanho da área de infarto é um aspecto crítico nos estudos, envolvendo terapia celular de regeneração miocárdica com células tronco, da mesma forma como tem sido empregada em estudos clínicos recentes24,25.

É relevante mencionar que a ecocardiografia tem sido amplamente utilizada na pesquisa pré-clínica, não apenas para estimar o tamanho do infarto miocárdico, mas também para fornecer medidas do grau de remodelamento ventricular esquerdo subsequente26.

No entanto, vale ressaltar que o emprego dos métodos de imagem que avaliam a função sistólica ventricular esquerda para mensurar de forma indireta a extensão do infarto miocárdico está sujeito a vários fatores que podem levar à imprecisão. A estimativa do tamanho do infarto miocárdico a partir da extensão da área de dissinergia contrátil pode ser contaminada por fatores confusores, como a presença de miocárdio viável, mas transitoriamente disfuncionante (miocárdio atordoado) e a mudança do grau de atividade contrátil vicariante das paredes distantes à área de infarto. Esses fatores podem mascarar os resultados de terapias voltadas para o salvamento do miocárdio isquêmico ou aquelas agindo sobre o remodelamento cardíaco27.

Portanto, o aspecto central envolvido na comparação entre os diferentes métodos para avaliação do tamanho do infarto é que as imagens de SPECT de perfusão miocárdica podem avaliar funcionalmente a extensão do miocárdio viável e, consequentemente, o tamanho do miocárdio necrosado. Essa avaliação direta funcional/metabólica independe do status de mobilidade das paredes, ou seja, mesmo áreas atordoadas seriam julgadas como viáveis e as áreas "encabrestadas" (áreas de fibrose/necrose exibindo mobilidade por estarem ancoradas em segmentos circunvizinhos com contratilidade aumentada) seriam corretamente julgadas como necróticas. Desse modo, reproduzindo o que a literatura internacional já demonstrou em estudos clínicos, julgamos que a avaliação funcional/metabólica cintilográfica acrescenta importantes informações para diagnóstico do miocárdio viável e, por extensão, da necrose miocárdica, além do que a avaliação da mobilidade segmentar parietal pode fornecer. Acreditamos, assim, que imagens de SPECT de perfusão miocárdica serviriam como uma ferramenta adicional aliada ao ecocardiograma (este sendo o método padrão para medir o grau de remodelamento e da disfunção sistólica) para avaliação mais completa dos modelos de cardiopatia isquêmica, assim como para medir o impacto de terapias celulares de regeneração miocárdica.

Conclusão

O sistema desenvolvido apresentou alta resolução espacial e elevada acurácia para detecção e quantificação das áreas de fibrose miocárdica, sendo uma opção de baixo custo e grande versatilidade para obtenção de imagens em SPECT de alta resolução de órgãos de pequenos animais.

As facilidades tecnológicas descritas e validadas no presente estudo têm o potencial de contribuir para popularizar o emprego da avaliação funcional com imagens cintilográficas na pesquisa pré-clínica cardiológica no cenário científico brasileiro.

Fontes de financiamento

O presente foi estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), com processos 07/50339-3 e 2011/03261-4, pela Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência (FAEPA) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP) da Universidade de São Paulo (USP) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). JM recebeu bolsa do Programa de Apoio a Jovem Pesquisador em Centros Emergentes.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Mejia J, Galvis-Alonso OY, Simões MV; Obtenção de dados: Oliveira LFL, Mejia J, Carvalho EEV, Lataro RM, Frassetto SN, Fazan Jr. R, Salgado HC; Análise e interpretação dos dados: Oliveira LFL, Carvalho EEV, Lataro RM, Simões MV; Análise estatística: Oliveira LFL, Carvalho EEV; Obtenção de financiamento: Mejia J; Redação do manuscrito: Oliveira LFL; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Oliveira LFL, Mejia J, Galvis-Alonso OY, Simões MV.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pela FAPESP, FAEPA-HCFMRP e CNPq.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Luciano Fonseca Lemos de Oliveira pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.

Marcus Vinicius Simões

Divisão de Cardiologia - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

Av. Bandeirantes 3900

CEP: 14048-900 - Ribeirão Preto - São Paulo

Email:

msimoes@fmrp.usp.br

Artigo recebido em 1/9/12, revisado em 17/9/12, aceito em 6/3/13.

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BACKGROUND: Imaging techniques enable in vivo sequential assessment of the morphology and function of animal organs in experimental models. We developed a device for high-resolution single photon emission computed tomography (SPECT) imaging based on an adapted pinhole collimator. OBJECTIVE: To determine the accuracy of this system for quantification of myocardial infarct area in rats. METHODS: Thirteen male Wistar rats (250 g) underwent experimental myocardial infarction by occlusion of the left coronary artery. After 4 weeks, SPECT images were acquired 1.5 hours after intravenous injection of 555 MBq o f 99mTc-Sestamibi. The tomographic reconstruction was performed by using specially developed software based on the Maximum Likelihood algorithm. The analysis of the data included the correlation between the area of perfusion defects detected by scintigraphy and extent of myocardial fibrosis assessed by histology. RESULTS: The images showed a high target organ/background ratio with adequate visualization of the left ventricular walls and cavity. All animals presenting infarction areas were correctly identified by the perfusion images. There was no difference of the infarct area as measured by SPECT (21.1 ± 21.2%) and by histology (21.7 ± 22.0%; p=0.45). There was a strong correlation between individual values of the area of infarction measured by these two methods. CONCLUSION: The developed system presented adequate spatial resolution and high accuracy for the detection and quantification of myocardial infarction areas, consisting in a low cost and versatile option for high-resolution SPECT imaging of small rodents.

 Myocardial Infarction Rats Tomography, Emission-Computed

ORIGINAL ARTICLE

Myocardial infarction area quantification using high-resolution SPECT images in rats

Luciano Fonseca Lemos de OliveiraI; Jorge MejiaII; Eduardo Elias Vieira de CarvalhoI; Renata Maria LataroI; Sarita Nasbine FrassettoI; Rubens Fazan JrIII; Hélio Cesar SalgadoIII; Orfa Yineth Galvis-AlonsoII; Marcus Vinícius SimõesI

IDivisão de Cardiologia, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP

IIDepartamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, São José do Rio Preto, SP

IIIDepartamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP - Brasil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Imaging techniques enable in vivo sequential assessment of the morphology and function of animal organs in experimental models. We developed a device for high-resolution single photon emission computed tomography (SPECT) imaging based on an adapted pinhole collimator.

OBJECTIVE: To determine the accuracy of this system for quantification of myocardial infarct area in rats.

METHODS: Thirteen male Wistar rats (250 g) underwent experimental myocardial infarction by occlusion of the left coronary artery. After 4 weeks, SPECT images were acquired 1.5 hours after intravenous injection of 555 MBq of 99mTc-Sestamibi. The tomographic reconstruction was performed by using specially developed software based on the Maximum Likelihood algorithm. The analysis of the data included the correlation between the area of perfusion defects detected by scintigraphy and extent of myocardial fibrosis assessed by histology.

RESULTS: The images showed a high target organ/background ratio with adequate visualization of the left ventricular walls and cavity. All animals presenting infarction areas were correctly identified by the perfusion images. There was no difference of the infarct area as measured by SPECT (21.1 ± 21.2%) and by histology (21.7 ± 22.0%; p=0.45). There was a strong correlation between individual values of the area of infarction measured by these two methods.

CONCLUSION: The developed system presented adequate spatial resolution and high accuracy for the detection and quantification of myocardial infarction areas, consisting in a low cost and versatile option for high-resolution SPECT imaging of small rodents.

Keywords: Myocardial Infarction; Rats; Tomography, Emission-Computed.

Introduction

In the last decades, lab animals have become important tools in pre-clinical research1. In Cardiology, small animals have been successfully used for reproducing various cardiac disease models and their results have allowed the study of new drugs, as well as the study of cardiac disease physiopathological mechanisms2-5.

On exploring of these animal models, although many experimental variables can be evaluated in vivo, in the majority of cases the animal must be sacrificed and the organ of interest excised and processed for obtaining results. This process eliminates the possibility of multiple evaluations along the time. On the other hand, the recent development of in vivo imaging techniques in small animals allowed the non-invasive sequential assessment of organ structure and function, saving time and animals and reducing cost.

The equipments in clinical use, based in ultrasond and magnetic resonance imaging, show sufficient sensivity and spatial resolution for imaging small animals organs, whose linear dimensions are, in average, 10 to 30 times smaller than that of human organs. However, conventional clinical SPECT (single-photon emission computed tomography) equipment allows spatial resolution of approximately 6 mm. This is not appropriate for imaging small animals organs, for which the required spatial resolution is approximately 1 mm.

Our research group has recently described the implementation of a high-definition SPECT imaging system based on a pinhole collimator (with only one hole), a rotational support system for the small animal and appropriate software tools adapted to a gamma chamber for clinical use6,7. The objective of the present study was to validate this system for quantification in vivo of the myocardial fibrosis area in an experimental model of myocardial infarct in rats that uses as gold standard the in vitro histopathologic infarct measurement.

Methods

Construction and adaptation of the tomographic images acquisition system

A clinical gamma chamber (DST/Sopha Medical Vision, Twinsburg, Ohio, USA) was adapted by the construction of a shielding system that allowed the fixation of a 1.5 mm diameter simple orifice collimator, with a 150º total opening angle. This shielding system was pyramid-shaped and covered with a 6 mm lead mantle which was adequate for photons in the range of 150 keV. Additionally, a cylindrical support was developed for positioning the animal. This support is coupled to a motorized system, which allowed rotating the target to different angular positions, according to the number of projections to be registered throughout the 360º tomographic acquisition. Synchronized with the dynamic acquisition protocol of the gamma chamber, the projection sequence was registered and stored in DICOM format. The hardware set is illustrated on Figure 1.

Reconstruction software implementation

After acquiring the projections, the registered images were exported in DICOM format to a personal computer and were then processed for obtaining a tridimensional model for the radioactive drug distribution within the target 7.In order to do this, we have developed an iterative image reconstruction software, based on the Maximum Likelihood algorithm8. The mathematical details of the iterative reconstruction calculations were published previously7. Even though the iterative reconstruction is slower than the filtered backprojection classic algorithm, it produces better quality images, in terms of the signal-noise rate and spatial resolution, and allows better modeling of the physical process involved in image acquisition9,10. The tool was implemented in C language, using a freeware Dev-V++ compiler (Bloodshed Software). The freeware Amide Medical Image Data Examiner11 was used for the final visualization of the reconstructions.

Phantom Images

In order to verify the systems tomographic spatial resolution, hot bar phantom images were acquired. This phantom consists in four sets of cylindrical spaces with different diameters (1, 2, 3 and 4 mm), filled with sodium pertechnetate and separated by a distance equal to two times their diameter (Figure 2A). The same parameters employed for image acquisition of the experimental animals were used in the acquisition of the phantom images.

Experimental animals

After the approval of our institutions Ethical Committee in Animal Experimentation, the experiments were performed with 15 male Wistar rats weighing initially 250 g. The animals were provided by the central biotery of the same institution, kept in a climatized animal house, with free access to water and standard food, and submitted to a 12 hour light/shadow rhythm with controlled temperature. In all the procedures, maximum effort was done to avoid unnecessary suffering of the animals.

Experimental myocardial infarction induction

Experimental myocardial infarct was induced in 13 animals using the method described by Pfeffer et al12, with slight modifications. Two animals were maintained as non-infarct controls. The surgical procedures were performed under anesthesia with ketamine (50 mg/kg IM, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brasil) and xylazine (10 mg/kg IM, HertapeCalier Saúde Animal S/A, Juatuba, MG, Brasil) and orotracheal intubation for mechanical ventilation (Advanced Safety Ventilator, Harvard Apparatus, MA1 55-7059, Holliston, MA, USA). After that, the heart was exposed by an incision in the third left intercostal space and the anterior descendent branch of the left coronary artery was identified and ligated with a polyester thread (4-0, Ethicon, São José dos Campos, SP, Brasil). After that, the thorax was closed and the animals taken to our institutions Physiology Department Biotery for recovery.

Myocardial perfusion images acquisition

The animals were submitted to imaging 4 weeks after the experimental myocardial infarct induction. For the imaging protocol, the animals were anesthetized with a combination of ketamine and xylazine (50 e 5 mg/kg, respectively). A 555 MBq de 99mTc-Sestamibi activity was injected in the tail vein. Ninety minutes after the injections, the animals were anesthetized again with ketamine and xylazine (75 and 7.5 mg/kg, respectively) and positioned in the imaging system.

Thirty-six projections, equally spaced within 360º, were obtained in all imaging protocols. The projections were recorded in a 128 x128 matrix, each element with a 3.4 mm x 3.4 mm area. A 6.3X magnification factor was adopted for all experiments, corresponding to a lateral dimension of the volumetric picture element (or voxel) of 0.54 mm. The imaging time was 30 seconds for each projection, totaling approximately 21 minutes per animal.

No deaths were recorded in association to imaging within 4 weeks of the infarction.

Myocardial perfusion images processing and analysis

After reconstructing SPECT images with an iteractive reconstruction algorithm, the image was properly rotated and tomographic slices were selected from the short, long vertical and long horizontal axis. The images were normalized for the myocardial pixel with the maximum uptake value within the volume and submitted to visual analysis.

Four short axis tomographic slices from different levels within the left ventricular chamber were used for quantifying the perfusional defect in SPECT images: one apical slice, two medium-ventricular slices and one basal slice. Using ImageJ (a free image processing software), the intensity profile was determined at the left ventricle (LV) myocardial circumference. The areas with perfusion defects were identified by the presence of pixels with uptake values below 50% in comparison to the pixel showing the maximum caption accumulation in the myocardium. The total extension of the myocardial perfusion defect was expressed as a LV area percentage, and calculated by dividing the total pixel number with uptake < 50% (from the four slices) by the total pixel number of the LV circumferential profile in the four tomographic slices that were analyzed, multiplied by one hundred.

A single investigator, blind to the histologic analysis results, was responsible for the quantitative image processing.

Histology

For histopathologic analysis after euthanasia, the heart was rapidly excised and fixed in 10% formaldehyde for 24 hours, and, afterwards, transferred to 70% alcohol. The samples were progressively dehydrated and embedded in paraffin. Histologic slices were produced following the plane perpendicular to the hearts long axis, in order to reproduce the short axis slices obtained in the in vivo myocardial perfusion studies. The slices were stained with Massons trichrome stain for the perfect identification of fibrosis areas, which are stained in blue.

For fibrosis area quantification in the histologic studies, the tomographic slices were processed similarly to the ones used in the in vivo perfusion studies. In summary, the images corresponding to the four slice levels in the left ventricular chamber were digitalized with the help of a scanner. A circumferential profile following LV wall conformation was delineated by the ImageJ software, and the linear extension of LV circumference was computed for each slice. The fibrosis-stained myocardial tissue linear extension was also identified and quantified in each slice. The myocardial fibrosis extension, expressed as a percentage of the LV surface area, was calculated by dividing the fibrotic tissue total extension in the four slices by the total LV circumferences extension in the four slices and multiplying the final value by 100.

A single investigator, blind to the results obtained in the in vivo images, quantified the fibrosis areas in histologic studies.

Statistical analysis

The results were expressed as mean and mean standard deviation. The variable Gaussian distribution was verified by the Kolmogorov-Smirnov test. The paired t Student test was used for comparing the mean in vivo and histologic myocardial fibrosis extension values. The linear regression test and least square method were used for analyzing the correlation between the individual results obtained with each method. The Bland-Altman graphic method was used for additional concordance analysis between the fibrosis area measurements obtained by the two employed methods.

Results

Spatial resolution of tomographic images

Figure 2B shows the tomographic images of the micro-Jasczak phantom radioactivity filled bars reconstructed from the transversal slices, in a section perpendicular to the long axis. In a visual semi quantitative analysis, it is possible to clearly identify the contours of the group bars with internal diameters of 2 mm, though the image resolution is lost at 1 mm internal diameter, which suggests that the spatial resolution limit is within the 1-2 mm range. More precise spatial resolution determination was possible by analyzing the count profile from a linear source (PSF), which led to a 1.5 mm spatial resolution (full width at half maximum). The pixel size in the imaged object was 0.6 mm.

Visual analysis of the myocardial perfusion images

Figure 3 shows images of the myocardial perfusion SPECT of one of the control animals, used for the initial imaging visualization standardization. High target-organ/background count ratio was observed; the wall limits and LV chamber delineation, as well as RV walls in some of the medium-chamber slices, were clearly visualized. The control animals images show uniform distribution of the radiotracer among different myocardial follow-ups, with the exception of the apex, which showed smaller uptake intensity, ascribed to the parietal thinning of the apical region. However, these values were not inferior to 50% in comparison to the maximum myocardial uptake accumulation pixel.

The image quality of the infarcted animals (Figure 4) and the control animals is comparable; besides, the uptake defect was clearly identified in territories compatible with the left coronary artery irrigation area in the rat (anterior and anterolateral walls and apical region) in all animals, with significant infarct areas confirmed by histology.

Quantitative analysis of the myocardial infarction areas

In Figure 5, we can compare SPECT myocardial perfusion tomographic images of the slices with the corresponding histologic images that were used for quantifying, respectively, the perfusional defect and the fibrosis area. Great similarity of the wall morphology, as well as the myocardial perfusional defect extension and topography, can be seen between SPECT images and histologic studies.

The myocardial infarction area quantified by histology was 21.7 ± 22.0% of the LV surface. The myocardial infarct area dimensions showed great variation among animals, ranging from 26.5 to 55.0%. Six animals did not show significant fibrosis areas in the histopathologic study.

All the animals with significant myocardial fibrosis in the histopathologic study were correctly identified by the presence of uptake defects in myocardial perfusion defects. The LV surface area in which an uptake defect detected at the myocardial perfusion SPECT (infarct area) was 21.1 ± 21.2% (ranging from 30.0 to 50.0%); the results were similar to the obtained in the histologic study (p=0.45).

Excellent correlation was obtained between individual SPECT myocardial uptake defect values and histologic myocardial fibrosis extension by using linear regression analysis (n = 13. r = 0.99; p < 0.0001). In the dispersion graphic, a slope=1.03, almost superimposed to the identity line between the results, can be seen (Figure 6).

High concordance between the results of both methods is showed by plotting the data according to the graphic method for Bland-Altman measurement concordance analysis (Figure 7). As the graphic shows, the mean difference between measurements was -0.6, a value close to zero (the ideal value). The individual values of the measurement differences are distributed in a narrow range around the mean, within the representative bars of two standard deviations, demonstrating that the variation limit for the difference between measurements was fairly acceptable (±5,4%).

Discussion

In this study, we describe a system for obtaining high resolution SPECT images in small animals based on a pinhole collimator coupled to a rotational support and adapted to a clinical gamma-chamber. To the best of our knowledge, this is the first time an equivalent device is developed in Latin America. This systems performance allowed identifying 1-2 mm structures with 1.5 mm spatial resolution (FWHM) and a 0.6 mm pixel size. These values are similar to the ones reported in other studies describing systems adapted in clinical gamma-camera 13-15 and systems especially built for small animals16-18.

In addition to their high spatial resolution, the myocardial perfusion SPECT images obtained both from infarct and control animals achieved quality comparable to human images, with adequate visualization of the left ventricle walls and chamber, as well as right ventricle wall visualization in some slices, with a high target-organ/background count ratio.

The wall morphology and infarct area topography, according to myocardial perfusion SPECT images of the animals submitted to experimental infarct, were very similar to the ones obtained in the histopathologic study. Additionally, the myocardial perfusion defect extension showed high correlation with the infarct area histologic measurement. Regarding accuracy in the quantification of the infarct area extension, our results are comparable to the ones reported in other studies in with rats and mice were used with other high resolution scintigraphic imaging systems13,14,18-20. The findings suggest that, as a whole, the systems performance and accuracy is comparable to the commercially available dedicated systems.

An open architecture imaging system, such as the one described here, is very versatile, since, besides being easily coupled to other gamma-camera, it allows, with small configuration changes, imaging different sized animals ranging from 30 to 800 g. These changes consist in changing the rotational support to others with different widths and adjusting the distance between the animal to be studied and the pinhole, leading to different magnification of the imaged object. This versatility allows also adjusting for the optimization of the imaging parameters of different modalities of cardiac scintigraphic studies in the same animal (e.g., tomographic and planar nuclear ventriculography and perfusion gated-SPECT) and for obtaining functional imaging of different organs (e.g., brain, kidney, thyroid and lungs). Besides, when compared to the commercially available SPECT imaging systems dedicated to small animals, the construction costs of the system described here are incomparably smaller. Approximately $ 5,000 was invested in the materials and the skilled labor employed in its physical assemblage. The reconstruction software development employed freeware platforms and the mathematical formulas and algorithms of the software had been previously published7.

Other additional technical aspect must be presented in order to explain the advantages of configuring this kind of imaging system, in which the target (the small animal) is rotated in front of the detector. SPECT images are based on the acquisition of a planar images (projections) set in different angles around an object. In a clinical scenario, the projections are usually obtained by parallel collimators, so that the detector head rotates circumferentially around the patient, yielding images with a spatial resolution of approximately 6 mm (width at half the height)21. In order to image small animals organs, it is technically more advantageous to rotate the animal, and not the detector, for obtaining the projections. This way, most misalignments and oscillations caused by the gamma-camera detector head movement are eliminated, and the construction costs and the systems operation space are minimized.

Differently from what happens when parallel hole collimators are used, there is an implicit magnification factor of the pinhole collimator. This magnification is related to the ratio between the distances of the detector and collimator and the target object and the collimator. The closer the pinhole, the greater the magnification factor of the object being studied. It is also important to highlight that the systems sensitivity (the count accumulation rate) is a function of the collimator hole area. With our equipment, it is possible to used different lead or gold hole diameters (ranging from 0.5 to 2.0 mm), as well as multiple hole collimators, which can optimize the scintigraphic imaging process.

Various points can be selected to highlight the importance of high resolution perfusion imaging in ischemia/reperfusion and ischemic cardiopathy experimental models. Myocardial infarct induction is the heart failure/left ventricular dysfunction model most frequently used in pre-clinical research22. The precise quantification of fibrosis extension using imaging methods in vivo may be relevant for characterizing such models, allowing the selection of more homogeneous animals regarding infarct size, as well the longitudinal assessment of the effect of anti-ischemic therapies and myocardial reperfusion strategies, similarly to the described in myocardial perfusion SPECT clinical studies23.

On the other side, the sequential evaluation of the infarct area dimensions is a critical aspect of the studies on stem cell therapies for myocardial regeneration, much in the same way it has been employed in recent clinical studies24,25. .

It is relevant to mention that echocardiography has been broadly used in pre-clinical research, not only for estimating myocardial infarct dimensions, but also for measuring the subsequent left ventricle remodelation degree26.

However, it must be highlighted that the utilization of imaging methods that evaluate left ventricular systolic function for measuring indirectly the myocardial infarct extension is subject to various factors that can lead to inaccuracy. The estimation of the myocardial infarct dimensions by the contractile dissinergy area extension can be contaminated by confounding factors, such as the presence of viable, but transiently dysfunctional, myocardium (stunned myocardium) and the change in the vicarious contractile activity degree of the walls distant from the infarct area. These factors can mask the results of therapies aimed at ischemic myocardial salvage or those acting on cardiac remodeling27.

Thus, the central aspect involved in the comparison of different methods for evaluating infarct size is that myocardial perfusion SPECT can evaluate functionally the extension of viable myocardium and, consequently, the extension of necrotic myocardium. This direct functional/metabolic evaluation does not depend on the wall mobility status, that is, even stunned areas would be judged viable and "tethered" myocardium (fibrosis/necrosis areas exhibiting mobility since they are anchored in circumjacent segments with enhanced contractility) would be correctly judged necrotic. So, reproducing what the international literature has demonstrated in clinical studies, according to our judgment, the scintigraphic functional/metabolic assessment adds important information to the diagnosis of viable myocardium and, by extension, myocardial necrosis, in addition to the information provided by segmental mobility. We believe, thus, that myocardial perfusion SPECT would be an additional tool to echocardiogram (which is still the standard method for measuring the systolic dysfunction and remodeling degree) for more complete evaluation of the ischemic cardiopathy models, as well as measuring the impact of myocardial regeneration cell therapies.

Conclusion

The system developed by us showed high spatial resolution and accuracy in the detection and quantification of myocardial fibrosis areas. It is a low cost tool with great versatility for high resolution SPECT imaging of small animals organs.

The technological improvements described and validated in the present study may potentially contribute to the popularization of scintigraphic functional assessment in the pre-clinical cardiologic research in the Brazilian scientific setting.

Funding

The preset study was funded by the São Paulo research Foundation (FAPESP), processes 07/50339-3 and 2011/03261-4, by the Teaching and Assistance Foundation (FAEPA) of the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto (HCFMRP), São Paulo University (USP) and National Council for Scientific and Technological Development (CNPq). JM was granted a scholarship of the Emergent Centers Young Researcher Support System.

Author contributions

Conception and design of the research: Mejia J, Galvis-Alonso OY, Simões MV; Acquisition of data: Oliveira LFL, Mejia J, Carvalho EEV, Lataro RM, Frassetto SN, Fazan Jr. R, Salgado HC; Analysis and interpretation of the data: Oliveira LFL, Carvalho EEV, Lataro RM, Simões MV; Statistical analysis: Oliveira LFL, Carvalho EEV; Obtaining funding: Mejia J; Writing of the manuscript: Oliveira LFL; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Oliveira LFL, Mejia J, Galvis-Alonso OY, Simões MV.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was partially funded by FAPESP, FAEPA-HCFMRP and CNPq.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Luciano Fonseca Lemos de Oliveira, from Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.

References