FUNDAMENTO: A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma das mais importantes causas de insuficiência cardíaca na América Latina. A terapia celular vem sendo investigada como uma possível opção terapêutica para pacientes com doenças cardiovasculares. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da terapia com células-tronco mesenquimais em um modelo experimental de cardiomiopatia chagásica crônica. MÉTODOS: Camundongos C57BL/6 foram infectados com 1000 tripomastigotas da cepa Colombiana de T. cruzi e, após seis meses de infecção, foram tratados com células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (CTTAs) ou com meio DMEM (controle). O grupo tratado recebeu duas injeções intraperitoneais de CTTAs (1x106 células / dose), com um mês de intervalo entre as duas doses. Antes e após 1 e 2 meses de tratamento, os animais chagásicos e controles normais foram submetidos à eletrocardiograma e teste ergoespirométrico. Todos os animais foram sacrificados sob anestesia após 2 meses de tratamento, para análise histopatológica do coração. RESULTADOS: Não foi observada melhora de arritmias e da função cardiovascular no grupo tratado com CTTAs, porém secções de corações de camundongos deste grupo apresentaram uma redução significativa do número de células inflamatórias (p < 0,0001) e da área de fibrose (p < 0,01) em comparação com animais chagásicos tratados com DMEM. CONCLUSÃO: Deste modo, conclui-se que a administração de CTTAs por via intraperitoneal é capaz de reduzir inflamação e fibrose no coração de camundongos cronicamente infectados por T. cruzi, porém não teve efeitos na função cardíaca dois meses após o transplante.
ICentro de Pesquisas Gonçalo Moniz - Fundação Oswaldo Cruz
IIHospital São Rafael, Salvador, BA - Brasil
A doença de Chagas, desencadeada após a infecção pelo protozoário flagelado
Diversas pesquisas sobre o potencial terapêutico do transplante de células-tronco têm sido realizadas nos últimos anos, sobretudo na área das doenças cardiovasculares. Bocchi e cols.2 estudaram o efeito de células mononucleares de medula óssea, em pacientes portadores de insuficiência cardíaca não isquêmica refratária, tendo sido evidenciada melhora de fração de ejeção, classe funcional e qualidade de vida. Também foi demonstrado anteriormente que o transplante de células da medula óssea singênicas causa a melhora da miocardite chagásica em camundongos cronicamente infectados por
As células-tronco mesenquimais (CTM), encontradas no estroma de vários órgãos, incluindo a medula óssea, vêm sendo intensamente estudadas quanto às suas características e ao seu potencial terapêutico em diversos modelos experimentais pela facilidade com que podem ser obtidas e expandidas
Nesse contexto, o presente estudo testou a hipótese de que a terapia com células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo é capaz de reduzir inflamação e fibrose e melhorar a aptidão cardiorrespiratória em um modelo experimental de cardiomiopatia chagásica crônica em camundongos.
Trinta camundongos da linhagem C57BL/6 foram mantidos no biotério do Centro de Biotecnologia e Terapia Celular (CBTC) com água e comida
Vinte camundongos da linhagem C57BL/6 com seis a oito semanas de idade foram inoculados por via intraperitoneal com 1000 tripomastigotas da cepa Colombiana de
A linhagem de células-tronco do tecido adiposo (CTTA) humanas foi obtida a partir de material de descarte de lipoaspiração. Após incubação com colagenase (Blendzyme1, Roche), a preparação foi centrifugada, e as células foram cultivadas em meio DMEM acrescido de L-glutamina (2 mM/L), gentamicina (50 µg/mL), Hepes (10 mM) e 2 g/L de bicarbonato de sódio, enriquecido com 10% de soro fetal bovino, sendo mantidas em estufa a 37ºC a 5% de CO2. As CTTA foram isoladas de outras células mononucleares por sua capacidade de aderência ao plástico e de expansão, sendo posteriormente avaliadas quanto à expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo, potencial de diferenciação osteogênica e adipogênica e estabilidade cromossômica, comprovando as suas características de células mesenquimais.
Cada camundongo C57BL/6, seis meses após a infecção por
Após a indução de anestesia utilizando o sistema de isofluorano (0,5 a 2%), foi iniciada a aquisição dos registros eletrocardiográficos. Os registros de eletrocardiogramas foram adquiridos usando um equipamento Bio Amp PowerLab System (PowerLab 2/20; ADInstruments, Castle Hill, Australia), que permite o registro de sinais biológicos em animais com total isolamento elétrico. Os dados foram adquiridos e armazenados em computador, analisados no programa
Para os estudos de ergometria, foi utilizado o equipamento LE 8700 - CO (Panlab, Barcelona, Espanha), com fluxo de ar na câmara controlado por um trocador de gases (LE 400, Panlab). A amostra de gases foi levada por um circuito fechado ao analisador de gases (OXYLET 00, Panlab), sendo os dados enviados ao computador através de um amplificador contendo uma placa analógico-digital (ML 820, PowerLAb, ADInstruments, Austrália). Os dados foram armazenados em computador para análise no programa
Após eutanásia dos animais, os corações e fragmentos de músculo esquelético foram removidos e fixados em formalina 4%, para processamento histológico. Seções dos corações e dos músculos dos animais foram coradas por hematoxilina e eosina e analisadas por microscopia de campo claro, para a contagem de células inflamatórias, ou por tricrômio de Masson, para avaliação do percentual de fibrose. As quantificações foram realizadas em quatro cortes de 5 micrômetros de coração inteiro, com 20 a 30 micrômetros entre cada corte, depois de escaneamento utilizando o sistema Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA). As imagens foram analisadas com o programa Image Pro Plus (versão 7.0, Media Cybernetics, San Diego, CA).
Os dados obtidos foram avaliados considerando distribuição paramétrica, com o auxílio dos programas Graphpad Prism 5 (2007) e BioCalc. Para as comparações de intervalo PR, duração do QRS e frequência cardíaca foi utilizado o one-way ANOVA com pós-teste Tukey. O teste de Fisher foi utilizado para comparar os percentuais de animais com arritmias. O teste
O estudo foi iniciado com 30 camundongos da linhagem C57BL/6, divididos em três grupos: controles não infectados (n = 10); chagásicos crônicos tratados com DMEM (n = 10); e chagásicos crônicos tratados com CTTA (n = 10). Não houve óbitos entre os animais não infectados e os tratados com DMEM. Foram observados dois óbitos no grupo de animais tratados com CTTA, e um deles ocorreu ainda em fase considerada pré-tratamento, por acidente hemorrágico abdominal durante a infusão intraperitoneal das células-tronco. O segundo óbito nesse grupo ocorreu cerca de um mês após o transplante das CTTA, por causa não identificada. Não houve significância estatística no índice de sobrevida entre os grupos.
Na análise dos intervalos eletrocardiográficos, não houve diferença com significância estatística entre os animais chagásicos dos dois grupos de animais chagásicos, quando comparados entre si. Houve significância estatística, com p < 0,001, quando comparado o intervalo PR dos animais não infectados com os animais chagásicos tratados com DMEM ou com CTTA, o que não ocorreu com o intervalo QTc. Não houve influência da terapia com CTTA no prolongamento do intervalo PR, quando avaliado esse grupo nas fases pré e pós-tratamento. Os intervalos PR e QTc permaneceram estáveis nos dois grupos de animais chagásicos durante todo o período avaliado (
Na avaliação quanto à presença de arritmias cardíacas, dentre os animais chagásicos tratados com DMEM, dois animais evoluíram com BAVT. Três animais desse grupo já tinham BAVT na fase pré-tratamento, e dois passaram a cursar concomitantemente com frequentes extrassístoles ventriculares na fase pós-tratamento.
Entre os camundongos tratados com CTTA, três animais tinham BAVT, na fase pré-tratamento, e um deles apresentou reversão da arritmia, passando a ter ritmo sinusal, o que não ocorreu em nenhum dos animais tratados com DMEM. De quatro animais do grupo CTTA com ECG normal, um evoluiu com BAV de 2º grau tipo II e três animais evoluíram com BAVT.
As diferenças entre os percentuais de arritmias em geral e de BAVT não atingiram significância estatística quando comparados os grupos tratados com DMEM ou com CTTA. Também não se observou diferença quando os grupos foram comparados entre si nos dois tempos de infecção, apesar de ter sido observada uma tendência ao aumento de arritmias nos dois grupos estudados. Para arritmias em geral, os percentuais foram de 57% e 71% nos animais tratados com DMEM, e de 33% e 78% nos animais tratados com CTTA, nas fases pré- e pós-tratamento, respectivamente. Para BAVT, os percentuais foram de 43% e 71% nos animais tratados com DMEM, e de 33% e 56% nos animais tratados com CTTA, nas fases pré e pós-tratamento, respectivamente (
Em relação aos parâmetros de tempo de exercício, distância percorrida, velocidade final e estágio máximo alcançado, não houve diferença com significância estatística entre os animais chagásicos dos dois grupos, quando comparados um com o outro, ou quando considerados isoladamente, nas fases pré- e pós-tratamento. Todos os parâmetros foram significativamente diferentes entre os animais não infectados e os chagásicos em geral. O tempo de exercício, em segundos, foi 2577 ± 371 nos animais não infectados; 1840 ± 342 e 1620 ± 690 nos animais do grupo DMEM nas fases pré e após 2 meses de tratamento, respectivamente; e de 1570 ± 436 e 1278 ± 454 nos animais do grupo CTTA nas fases pré e pós-tratamento, respectivamente. A distância percorrida, em metros, foi 730 ± 187 nos animais não infectados; 396 ± 127 e 342 ± 171 nos animais do grupo DMEM nas fases pré e após dois meses de tratamento, respectivamente; e de 358 ± 131 e 221 ± 125 nos animais do grupo CTTA nas fases pré e pós-tratamento, respectivamente (
O grupo DMEM evoluiu, após o primeiro mês, com aumento do VO2, sendo esse valor mantido após o segundo mês de observação. O grupo CTTA apresentou uma tendência a elevação do VO2 após o tratamento, porém, erro padrão de significância estatística.
Quanto à produção de dióxido de carbono, observamos um aumento do VCO2 em repouso no grupo DMEM após o primeiro mês, mas não no grupo CTTA. Houve uma queda acentuada no VCO2 em repouso e no pico do esforço após o segundo mês nos grupos DMEM e CTTA, com significância estatística, quando comparados com o primeiro mês pós-tratamento.
O VO2 em repouso, em mL/Kg/min, foi 3959 ± 830 nos animais não infectados; 2779 ± 1004 e 3925 ± 1158 nos animais do grupo DMEM nas fases pré- e após dois meses de tratamento, respectivamente; e de 3442 ± 770 e 4094 ± 1203 nos animais do grupo CTTA nas fases pré- e pós-tratamento, respectivamente. No pico do esforço, esses valores foram 6107 ± 983 nos animais não infectados; 4213 ± 1438 e 5540 ± 1088 nos animais do grupo DMEM nas fases pré- e após dois meses de tratamento, respectivamente; e de 5479 ± 1061 e 5000 ± 1475 nos animais do grupo CTTA nas fases pré e pós-tratamento, respectivamente. O VCO2 em repouso, em mL/Kg/min, foi 3716 ± 1113 nos animais não infectados e 3544 ± 472 e 1779 ± 1222 nos animais do grupo DMEM nas fases pré- e após dois meses de tratamento, respectivamente; e de 3988 ± 366 e 1993 ± 1784 nos animais do grupo CTTA nas fases pré- e pós-tratamento, respectivamente. No pico do esforço, esses valores foram 5171 ± 1454 nos animais não infectados; 4894 ± 880 e 2393 ± 1610 nos animais do grupo DMEM nas fases pré- e após dois meses de tratamento, respectivamente; e de 5261 ± 688 e 2425 ± 1802 nos animais do grupo CTTA nas fases pré- e pós-tratamento, respectivamente (
Seções de corações de camundongos chagásicos crônicos apresentaram alterações histológicas características da cardiomiopatia chagásica crônica (
Na
Ao avaliar por morfometria a inflamação e fibrose de forma comparativa entre os dois grupos de animais chagásicos, observamos uma redução de fibrose e inflamação nos animais tratados com CTTA, com significância estatística. O número de células inflamatórias por mm2 foi de 228,5 ± 80,4 nos animais não infectados; de 758,4 ± 194,7 nos animais do grupo DMEM; e de 382,4 ± 91,9 nos animais do grupo CTTA. O percentual de fibrose no coração foi de 2,60 ± 1,78 nos animais não infectados; de 8,95 ± 3,31 nos animais do grupo DMEM; e de 3,89 ± 1,14 nos animais do grupo CTTA (
Além do coração, foi realizada a avaliação histopatológica de músculo esquelético. Tanto os animais chagásicos tratados com DMEM quanto os com CTTA apresentaram inflamação no músculo esquelético, caracterizando uma miosite intensa observada na fase crônica da doença (dados não mostrados).
Neste trabalho, foi demonstrada redução de inflamação e fibrose no coração de camundongos com miocardiopatia chagásica, induzida pela cepa Colombiana de
Os efeitos benéficos da terapia com células mesenquimais, através do seu potencial regenerativo, já foram demonstrados em diversos estudos clínicos e experimentais, como em doenças dos tecidos ósseo e cartilaginoso8, insuficiência renal9, doenças cardiovasculares10, pulmonares11, dentre outras. Além do potencial regenerativo, foi identificada ainda a atividade imunossupressora dessas células12,13, que são capazes de modular a função dos linfócitos T, fundamentais para o desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Portanto, é possível que os efeitos das CTTA na redução de fibrose e inflamação observados neste trabalho se devam a essa propriedade imunomoduladora, já descrita em diversos trabalhos na literatura. O fato de não ter sido evidenciada redução no percentual de arritmias sugere que pode não ter havido uma regeneração do tecido e/ou recuperação do sistema de condução cardíaco após a utilização desse esquema terapêutico, ao menos no tempo pós-tratamento avaliado.
No trabalho de Guarita-Souza e cols.6, ratos Wistar foram infectados com 15 x 104 tripomastigotas, desenvolvendo cardiomiopatia dilatada com disfunção sistólica de ventrículo esquerdo. Esses animais foram transplantados com cocultura de CTM e mioblastos esqueléticos, tendo sido observada, já após um mês do transplante, importante melhora da função e diâmetros ventriculares. A utilização de outro tipo celular juntamente com as CTM torna difícil avaliar o real papel das CTM neste modelo. É possível que os mioblastos esqueléticos atuem na recolonização das áreas fibróticas, promovendo, assim, a melhora da função cardíaca.
Em relação ao tipo celular utilizado em nosso estudo, algumas vantagens da utilização das células-tronco derivadas de tecido adiposo para o tratamento de doenças cardíacas em relação às de medula óssea já foram descritas anteriormente14, bem como a sua capacidade de diferenciação em cardiomiócitos15,16. Quanto à utilização de células xenogênicas (células humanas em camundongos), estudos prévios já demonstraram a segurança e a potencial eficácia dessas células, como o artigo publicado por Cai e cols.17 em modelo de infarto do miocárdio em ratos. Do mesmo modo, Hwangbo e cols.18 avaliaram o efeito do transplante de CTTA humanas em ratos Sprague-Dawley com infarto do miocárdio, com evidência de significativa melhora de função ventricular esquerda.
Em nosso estudo, optamos pela utilização da via intraperitoneal pelo fato de termos evidenciado em estudos anteriores a perda de animais por óbito após a administração de CTM por via endovenosa em camundongos. Em um trabalho realizado com insuficiência cardíaca refratária não isquêmica, foram utilizadas as vias endovenosa e intracoronariana, com resultados satisfatórios, porém as células estudadas foram as mononucleares, e não as mesenquimais2. Também utilizando células mononucleares de medula óssea, Nakamuta e cols.19 demonstraram maior retenção cardíaca das células, em modelo experimental de infarto do miocárdio, quando utilizada a via intramuscular. No entanto, Furlani e cols.20 avaliaram, por microscopia intravital, a cinética de migração de CTM humanas após a administração intravascular em camundongos SCID, através de um cateter inserido na aorta abdominal infrarrenal. Neste trabalho, o tamanho das CTM variou de 16 a 53 µm em suspensão, tendo sido observada interferência na microcirculação sanguínea conforme a densidade celular, com interrupção do fluxo sanguíneo e formação de trombo em arteríolas e vênulas nos animais nos quais foram injetadas as CTM. Em outro estudo, Gordon e cols.21 demonstraram o efeito terapêutico da injeção por via intraperitoneal de células-tronco mesenquimais humanas em camundongos com encefalomielite alérgica autoimune. Assim, além de não causar a perda de animais por embolia, esses trabalhos indicam que a via intraperitoneal de administração pode não comprometer os efeitos dessas células.
Uma limitação deste trabalho foi um viés na avaliação da ergometria causado pela presença de inflamação no músculo esquelético observada nos animais chagásicos. Mesmo nos animais que não apresentaram BAVT, observamos um pior desempenho no teste ergométrico, especialmente nos parâmetros de tempo de exercício e distância percorrida, além de claudicação de marcha. Ao avaliar a histologia e a morfometria de seções de músculo esquelético, encontramos uma grande quantidade de células inflamatórias, caracterizando miosite, considerada como fator ortopédico limitante para a progressão do esforço nos animais chagásicos no nosso trabalho. Em outro protocolo, estamos avaliando os efeitos da terapia com baixas doses de benzonidazol na miosite esquelética em camundongos cronicamente infectados por
Em resumo, este trabalho contribuiu para a avaliação os efeitos da terapia com CTTA na forma arrítmica da doença de Chagas, tendo demonstrado que o tratamento com as CTTA não reduziu a incidência de arritmias cardíacas em camundongos cronicamente infectados pela cepa Colombiana de
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pelo CNPq, FABESB e FINEP.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Ticiana Ferreira Larocca pelo Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz-Fiocruz.
Ticiana Ferreira Larocca Av. Alphaville, 634 Cond Alpha Life, Ed. Paradiso, ap. 202, Alphaville I CEP 41701-015, Salvador, BA - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 03/07/12, revisado em 10/12/12, aceito em 21/12/12.
BACKGROUND: Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a major cause of heart failure in Latin America. Tissue therapy has been investigated as a possible therapeutic option for patients with cardiovascular disease. OBJECTIVE: This study evaluated the effects of therapy with mesenchymal stem cells in an experimental model of chronic Chagasic cardiomyopathy. METHODS: C57BL/6 mice were infected with 1000 trypomastigotes from the Colombian strain of T. cruzi and, after six months of infection, were treated with mesenchymal human stem cells from adipose tissue (STAT) or with Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium - DMEM (control). The treated group received two intraperitoneal injections of STAT (1x10(6) cells/dose), with a month interval between the two doses. Before and after the first and second months of treatment, the chagasic and normal control animals underwent cardiopulmonary exercise testing and electrocardiography. All animals were sacrificed under anesthesia after two months of treatment for histopathological analysis of the heart. RESULTS: No improvement was observed in arrhythmias and cardiovascular function in the group of animals treated with STAT; however, sections of mice hearts in this group revealed a significant reduction in the number of inflammatory cells (p<0.0001) and areas of fibrosis (p<0.01) in comparison with chagasic animals treated with DMEM. CONCLUSION: Thus, it is concluded that administration of intraperitoneal STAT can reduce inflammation and fibrosis in the heart of mice chronically infected with T. cruzi; however, there were no effects on the cardiac function two months after transplantation.
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Chagas disease, triggered after infection with the flagellated protozoa
Several studies regarding the therapeutic potential of stem cell transplantation have been performed in recent years, especially in the area of cardiovascular diseases. Bocchi et al2 studied the effect of bone marrow mononuclear cells in patients with refractory nonischemic heart failure , resulting in improved ejection fraction, functional class and quality of life. It has also been previously demonstrated that transplantation of syngeneic bone marrow cells causes the improvement of chagasic myocarditis in mice chronically infected with T.
Mesenchymal stem cells (MSC), found in the stroma of various organs including bone marrow, have been intensively studied as to their characteristics and therapeutic potential in several experimental models due to the ease with which they can be obtained and grown
In this context, the present study tested the hypothesis that therapy with mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue is capable of reducing inflammation and fibrosis and improves cardiorespiratory fitness in an experimental model of chronic chagasic cardiomyopathy in mice.
Thirty mice of the C57BL/6 strain were kept in the animal house of the Center for Biotechnology and Tissue Therapy and provided with food and water
Twenty mice of the C57BL/6 strain, six to eight weeks old, were inoculated intraperitoneally with 1000 trypomastigotes of the Colombian strain of T.
The strain of human stem cells from adipose tissue (SCAT) was obtained from the disposal of liposuction material. After incubation with collagenase (Blendzyme1, Roche), the preparation was centrifuged and the cells were cultured in DMEM media, supplemented with L-glutamine (2 µmol/L), gentamicin (50 µg/mL), Hepes (10 µmol) and sodium bicarbonate (2 g/L), enriched with 10% bovine fetal serum and kept in the oven at 37ºC and 5% CO2. The SCAT were isolated from other mononuclear cells by their capacity to adhere to plastic and due to their expansion, being subsequently evaluated as to the expression of surface markers by flow cytometry, osteogenic and adipogenic differentiation potential and stability of chromosomes, confirming the characteristics of mesenchymal cells.
Each C57BL/6 mouse was transplanted intraperitoneally with 1 x 106 human SCAT , six months after the infection with T.
After induction of anesthesia using isoflurane (0.5 to 2%), the acquisition of electrocardiographic recordings was started. Recordings of electrocardiograms were acquired using Bio Amp PowerLab system equipment (PowerLab 2/20, ADInstruments, Castle Hill, Australia), which allows the recording of biological signals in animals with complete electrical isolation. Data were acquired and stored in a computer, and were then analyzed using the program Chart 5 for Windows (Power Lab; ADInstruments, Castle Hill, Australia). The ECG analysis included measurements of heart rate, adjusted PR and QT intervals and evaluation as to the presence of arrhythmias and conduction disturbances. To minimize interference a filter of 0.1 to 1 Hz was used.
For ergometric studies, LE 8700 - CO equipment (Panlab, Barcelona, Spain) was used, with air flow in the chamber controlled by a gas exchanger (LE 400, Panlab). A gas sample was taken by a closed circuit with the gas analyzer (OXYLET 00, Panlab), and the data was sent to the computer through an amplifier containing an analog-digital board (ML 820, PowerLab, ADInstruments, Australia). The data were stored on computer for analysis using the program Chart 5 for Windows - Metabolism for PowerLab System. The animals were placed on the treadmill for 20 minutes before exercise testing started. The initial speed was 12 cm/s, increasing the speed 6 cm/sec every 5 minutes. The first stage was established by the starting speed of 12 cm/s. After 5 minutes, the animal entered into the second stage with a speed of 18 cm/s, and so on. Tests were conducted until the animals reached exhaustion lasting for 5 seconds or showed signs of shock. To minimize interference a 0.1 to 1 Hz filter was used. The parameters evaluated were exercise time, distance covered, final speed, maximum stage reached, oxygen consumption, and carbon dioxide production.
After euthanasia of the animals, the hearts and fragments of the skeletal muscle were removed and fixed in 4% formalin for histological processing. Sections of hearts and muscles of the animals were stained with hematoxylin and eosin and analyzed by bright field microscopy to count inflammatory cells, or by Masson's Trichrome to evaluate the percentage of fibrosis. The measurements were performed on four sections of 5 micrometers whole heart, with 20 to 30 micrometers between each section, after scanning with the Aperio ScanScope system (Aperio Technologies, Vista, CA). The images were analyzed with the program Image Pro Plus (release 7.0, Media Cybernetics, San Diego, CA).
The data obtained were evaluated considering parametric distribution, with the aid of the Graphpad Prism 5 (2007) and BioCalc software. For comparisons of PR interval, QRS duration and heart rate one-way ANOVA with Tukey post-test was used. Fisher's test was used to compare the percentage of animals with arrhythmias. The unpaired
The study started with 30 mice of the C57BL/6 strain, divided into three groups: uninfected controls (n = 10); chronic chagasic animals treated with DMEM (n = 10), and chronic chagasic animals treated with SCAT (n = 10). There were no deaths among the uninfected animals and those treated with DMEM. Two deaths were observed in the group of animals treated with SCAT, and one of them was considered to still be in the pretreatment phase, with death being caused by abdominal hemorrhagic accident during intraperitoneal infusion of the stem cells. The second death in this group occurred approximately one month after transplanting CTTA due to a non-identified cause. There was no statistical significance in survival rate between the groups.
In the analysis of electrocardiographic intervals, no statistically significant difference was found between the two chagasic groups of animals when the two groups were compared. There was a statistically significant difference, with p < 0.001, when comparing the PR interval of uninfected animals with chagasic animals treated with DMEM or with STAT, which did not occur with the QTc interval. There was no STAT therapy influence in terms of prolongation of the PR interval when this group was assessed at the pretreatment and post-treatment phases. The PR and QTc intervals remained stable in both groups of chagasic animals throughout the study period (
In evaluating for the presence of cardiac arrhythmias, among the chagasic animals treated with DMEM, two animals experienced complete atrioventricular block (CAVB). Three animals in this group already had CAVB in the pre-treatment phase, and two developed it concurrently with frequent ventricular extrasystoles in the post-treatment phase.
Among mice treated with STAT, three animals had CAVB in the pre-treatment phase, and one of them showed arrhythmia reversal, with periods of sinus rhythm, which did not occur in any of the animals treated with DMEM. Of four animals in the STAT group with normal ECGs, one developed 2nd degree type II atrioventricular block (AVB) and three animals developed CAVB.
The differences between the percentages of animal arrhythmias in general, and CAVB in particular, did not reach statistical significance when comparing the groups treated with DMEM or STAT. Also, there was no difference when the groups were compared during the two times of infection, although a trend towards increased arrhythmias had been observed in both groups. For arrhythmias in general, the percentages were 57% and 71% in animals treated with DMEM, and 33% and 78% in animals treated with STAT, in pre-and post-treatment phases respectively. For CAVB, the percentages were 43% and 71% in animals treated with DMEM and 33% and 56% in animals treated with STAT, in pre-and post-treatment phases respectively (
Regarding the parameters of exercise time, distance traveled, final speed and maximum stage reached, there was no statistically significant difference between the two groups of chagasic animals, when compared with each other or when considered separately in the pre-and post-treatment phases. All parameters were significantly different between uninfected animals and chagasic animals in general. The exercise time, in seconds, was 2577 ± 371 in uninfected animals; 1840 ± 342 and 1620 ± 690 in the group of DMEM animals at pretreatment phase and after 2 months of treatment, respectively; and 1570 ± 436 and 1278 ± 454 in animals in the STAT group in the pre- and post-treatment phases, respectively. The distance run, in meters, was 730 ± 187 in uninfected animals; 396 ± 127 and 342 ± 171 in the group of DMEM animals at pretreatment phase and after 2 months of treatment, respectively; and 358 ± 131 and 221 ± 125 in animals of the STAT group in the pre- and post-treatment phases, respectively (
After the first month, the DMEM group developed an increase of VO2, with this value maintained after the second month of observation. The STAT group showed a tendency to increased VO2 after treatment; however, the standard error was of statistical significance.
As for the production of carbon dioxide, it was observed there was an increase of VCO2 at rest in the DMEM group after the first month, but not in the STAT group. There was a sharp drop in VCO2 at rest and at peak effort after the second month in the DMEM and STAT groups, with statistical significance when compared with the first month after treatment.
The VO2 at rest, in mL/Kg/min, was 3959 ± 830 in uninfected animals; 2779 ± 1004 and 3925 ± 1158 in animals of group DMEM in the pre-phase and after two months of treatment, respectively; and 3442 ± 770 and 4094 ± 1203 in the animals of the STAT group in the pre- and post-treatment phases, respectively. At peak stress, these values were 6107 ± 983 in uninfected animals; 4213 ± 1438 and 5540 ± 1088 in animals of the DMEM group in the pre-phase and after two months of treatment, respectively; and 5479 ± 1061 and 5000 ± 1475 in the animals of group STAT in the pre- and post-treatment phases, respectively. The VCO2 at rest, in mL/Kg/min, was 3716 ± 1113 in uninfected animals; 3544 ± 472 and 1779 ± 1222 in animals of group DMEM in the pre-phase and after two months of treatment, respectively; and 3988 ± 366 and 1993 ± 1784 in the animals of the STAT group in the pre- and post-treatment phases, respectively. At peak stress, these values were 5171 ± 1454 in uninfected animals; 4894 ± 880 and 2393 ± 1610 in animals of the DMEM group in the pre-phase and after two months of treatment, respectively; and 5261 ± 688 and 2425 ± 1802 in the animals of the STAT group in the pre- and post-treatment phases, respectively. (
Sections of hearts from chronic chagasic mice showed histological characteristics of chronic chagasic cardiomyopathy (
In
In evaluating and comparing, by morphometry, the inflammation and fibrosis between the two groups of chagasic animals, it was noticed there was a reduction of fibrosis and inflammation in animals treated with STAT, with statistical significance. The number of inflammatory cells per mm2 was 228.5 ± 80.4 in uninfected animals; 758.4 ± 194.7 for the animals of group DMEM, and 382.4 ± 91.9 in animals from group STAT. The percentage of fibrosis in the heart was 2.60.5 ± 1.78 in uninfected animals; 8.95 ± 3.31 in the animals of group DMEM; and 3.89 ± 1.14 in animals from group STAT (
In addition to the heart, a histopathological evaluation of skeletal muscle was performed. Both chagasic animals treated with DMEM and those treated with STAT showed inflammation in skeletal muscle, featuring an intense myositis observed in the chronic phase of the disease (data not shown).
This study demonstrated a reduction of inflammation and fibrosis in the hearts of mice with chagasic cardiomyopathy induced by the Colombian strain of
The beneficial effects of therapy with mesenchymal cells, through their regenerative potential, have already been demonstrated in several clinical and experimental studies, such as in diseases affecting bone and cartilage8, renal impairment9, cardiovascular disease10 and pulmonary11 diseases, among others. In addition to the regenerative potential, the immunosuppressive activity of these cells was also identified12,13, which can modulate the function of T lymphocytes , which are basic to the development of the adaptative immune response. Therefore, it is possible that the effects of STAT in reducing inflammation and fibrosis, as seen in this study, are due to this immunomodulating property, which has already been described in several articles in the literature. The fact that a reduction in the percentage of arrhythmias was not evident suggests that there may not have been tissue regeneration and/or recovery of the cardiac conduction system after using these therapy schemes, at least in the short post-treatment time assessed.
In the work of Guarita-Souza et al6, Wistar rats were infected with 15 x 104 trypomastigotes, subsequently developing dilated cardiomyopathy with left ventricular systolic dysfunction. These animals were transplanted with MSC coculture of skeletal myoblasts and, within one month of transplantation, an important improvement of ventricular function and diameters was observed. The use of another type of cell along with the MSC makes it difficult to evaluate the actual role of MSC in this model. It is possible that skeletal myoblasts act on the recolonization of fibrotic areas, thereby promoting the improvement of cardiac function.
In terms of the cellular type used in our study, a few advantages have been described previously with regards to the use of stem cells from adipose tissue for the treatment of cardiac diseases, in comparison to those of the bone marrow which have already been described14, as well as their differentiation capacity in cardiomyocytes15,16. As to the use of xenogenic cells (human cells in mice), previous studies have already shown the safety and potential effectiveness of these cells, such as the article published by Cai et al17 regarding a model of myocardial infarction in rats. Similarly, Hwangbo et al18 evaluated the effect of transplantation of human STAT in Sprague-Dawley rats with myocardial infarction, with evidence of significant improvement in left ventricular function.
In the present study, the intraperitoneal route was used because previous studies have reported the death of animals following administration of intravenous MSC. In a study of non-ischemic refractory heart failure, the intracoronary and intravenous routes were used with satisfactory results, but the cells studied were mononuclear and not mesenchymal cells2. Also using mononuclear cells derived from bone marrow, Nakamuta et al19 demonstrated greater cardiac cell retention in an experimental model of myocardial infarction when cells were implanted intramuscularly. However, Furlani et al20 assessed, by means of intravital microscopy, the kinetics of the migration of human MSC after intravascular administration in SCID mice via a catheter inserted into the infrarenal abdominal aorta. In this study, the size of the suspended MSC ranged from 16 to 53 µm, with interference being observed in blood microcirculation due to cell density, including interruption of blood flow and thrombus formation in arterioles and venules in the animals in which the MSC was injected. In another study, Gordon et al21 demonstrated the therapeutic effect of intraperitoneal injection of human mesenchymal stem cells in mice with autoimmune allergic encephalomyelitis. In addition to preventing loss of animals due to embolism, these studies indicate that intraperitoneal administration does not compromise the effects of these cells.
A limitation of this study is a bias in the evaluation of the ergometry, caused by the presence of inflammation in skeletal muscle observed in the chagasic animals. Even in animals that did not have CAVB, it was observed there was poor performance in exercise testing, especially in parameters of exercise time and distance run, in addition to a limping gait. In evaluating the histology and morphometry of sections of skeletal muscle, a large amount of inflammatory cells were identified, characterizing myositis, considered as a limiting orthopedic factor for the progression of stress in chagasic animals in our work. In another protocol, the effects of the therapy are evaluated with low doses of benznidazole in skeletal myositis in mice chronically infected with T.
In summary, this study contributed to evaluating the effects of therapy with STAT in the arrhythmic form of Chagas disease and has demonstrated that treatment with STAT did not reduce the incidence of cardiac arrhythmias in mice chronically infected with the Colombian strain of T.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by CNPq, FABESB and FINEP.
This article is part of the thesis of master submitted by Ticiana Ferreira Larocca, from Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz-Fiocruz.