abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC São Paulo, SP, Brazil 4hhfKQP7QR3Dk9XgJWyDKQC S0066-782X2013000400006 S0066-782X(13)10000400006 10.5935/abc.20130051 Artigos Originais Treinamento resistido controla a pressão arterial de ratos hipertensos induzidos por l-NAME Araujo Ayslan Jorge Santos de Santos Anne Carolline Veríssimo dos Souza Karine dos Santos Aires Marlúcia Bastos Santana-Filho Valter Joviniano Fioretto Emerson Ticona Mota Marcelo Mendonça Santos Márcio Roberto Viana São Cristovão Sergipe Universidade Federal de Sergipe Departamento de Fisiologia Brazil São Cristovão Sergipe Universidade Federal de Sergipe Departamento de Morfologia Brazil 04 2013 100 4 339 346 16 05 2012 08 11 2012 19 10 2012 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

FUNDAMENTO: A hipertensão arterial é uma síndrome multifatorial, crônica, causada tanto por fatores congênitos ou adquiridos. OBJETIVO: Avaliar os efeitos do treinamento físico resistido (TR) sobre pressão arterial, reatividade e morfologia vascular de ratos hipertensos induzidos por L-NAME. MÉTODOS: Ratos Wistar machos (200-250 g) foram divididos em 3 grupos: normotenso sedentário (NS), hipertenso sedentário (HS) e hipertenso treinado (HT). A hipertensão foi induzida pela administração de L-NAME (40 mg/kg) na água de beber por 4 semanas. A pressão arterial foi avaliada antes e após o TR. O TR foi realizado utilizando 50% de 1RM, em 3 séries de 10 repetições, 3 vezes por semana, durante quatro semanas. A reatividade vascular foi mensurada em artéria mesentérica superior por curvas concentração resposta ao nitroprussiato de sódio (NPS) e fenilefrina (FEN). Além disso, foram realizadas análises histológicas e estereológicas. RESULTADOS: O TR inibiu o aumento das pressões arteriais média e diastólica. Foi observada uma redução significativa na resposta máxima e na potência da FEN entre os grupos HS e HT. A análise histológica evidenciou aspecto normal para as túnicas íntima, média e adventícia em todos os grupos. Não houve diferença significativa nas áreas do lúmen, da túnica média e total das artérias dos grupos HS e HT em relação ao NS. A razão parede/lúmen arterial do grupo HS apresentou diferença significativa em relação ao NS (p < 0,05), mas esta não foi diferente do HT. CONCLUSÕES: O TR foi capaz de prevenir a elevação da pressão arterial sob as condições deste estudo. Este controle parece envolver a regulação de mecanismo vasoconstritor e a manutenção do diâmetro luminal de ratos hipertensos induzidos por L-NAME.

 Hipertensão Exercício Ratos Pressão Arterial Vasodilatação 02 04 2013

Treinamento resistido controla a pressão arterial de ratos hipertensos induzidos por l-NAME

Ayslan Jorge Santos de AraujoI; Anne Carolline Veríssimo dos SantosI; Karine dos Santos SouzaII; Marlúcia Bastos AiresII; Valter Joviniano Santana-FilhoIII; Emerson Ticona FiorettoII; Marcelo Mendonça MotaI; Márcio Roberto Viana SantosI

IDepartamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Sergipe - Brasil

IIDepartamento de Morfologia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Sergipe - Brasil

IIIDepartamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Sergipe - Brasil

Correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: A hipertensão arterial é uma síndrome multifatorial, crônica, causada tanto por fatores congênitos ou adquiridos.

OBJETIVO: Avaliar os efeitos do treinamento físico resistido (TR) sobre pressão arterial, reatividade e morfologia vascular de ratos hipertensos induzidos por L-NAME.

MÉTODOS: Ratos Wistar machos (200-250 g) foram divididos em 3 grupos: normotenso sedentário (NS), hipertenso sedentário (HS) e hipertenso treinado (HT). A hipertensão foi induzida pela administração de L-NAME (40 mg/kg) na água de beber por 4 semanas. A pressão arterial foi avaliada antes e após o TR. O TR foi realizado utilizando 50% de 1RM, em 3 séries de 10 repetições, 3 vezes por semana, durante quatro semanas. A reatividade vascular foi mensurada em artéria mesentérica superior por curvas concentração resposta ao nitroprussiato de sódio (NPS) e fenilefrina (FEN). Além disso, foram realizadas análises histológicas e estereológicas.

RESULTADOS: O TR inibiu o aumento das pressões arteriais média e diastólica. Foi observada uma redução significativa na resposta máxima e na potência da FEN entre os grupos HS e HT. A análise histológica evidenciou aspecto normal para as túnicas íntima, média e adventícia em todos os grupos. Não houve diferença significativa nas áreas do lúmen, da túnica média e total das artérias dos grupos HS e HT em relação ao NS. A razão parede/lúmen arterial do grupo HS apresentou diferença significativa em relação ao NS (p < 0,05), mas esta não foi diferente do HT.

CONCLUSÕES: O TR foi capaz de prevenir a elevação da pressão arterial sob as condições deste estudo. Este controle parece envolver a regulação de mecanismo vasoconstritor e a manutenção do diâmetro luminal de ratos hipertensos induzidos por L-NAME.

Palavras-chave: Hipertensão / fisiopatologia, Exercício, Ratos, Pressão Arterial / efeito de drogas, Vasodilatação / fisiopatologia.

Introdução

A hipertensão arterial (HA) é uma síndrome1 crônica multifatorial, causada por fatores congênitos ou adquiridos2. Seu tratamento envolve métodos3 farmacológicos e não farmacológicos. Entre os métodos não farmacológicos, o exercício físico (EF) tem sido uma das intervenções mais importantes indicadas para a prevenção ou controle da HA4,5.

Há uma relação positiva entre hipertensão e comportamentos sedentários6. Beunza e cols.6 demonstraram que o subtipo interativo dos comportamentos sedentários, tais como dirigir ou usar computador estava associado com um maior risco de hipertensão. Por outro lado, o subtipo não interativo, tal como assistir televisão e dormir não estava associado. Estes dados mostram a grande importância do EF crônico para a prevenção primária e tratamento de níveis elevados de pressão sanguínea4.

Muitos estudos têm focado nos efeitos do exercício aeróbico2-5, por isso eles têm sido recomendados na prescrição como adjuvantes de um tratamento anti-hipertensivo; no entanto, o conhecimento sobre os benefícios do treinamento resistido (TR) tem aumentado. Os efeitos positivos do TR crônico, tais como aumento do tono dos músculos esqueléticos, a inibição de fatores de risco e prevenção de obesidade também foram encontrados7. Estudos sugerem a adoção de um treinamento de força moderado certificando que não ocorra o efeito de aumento crônico da pressão arterial (PA)8.

De acordo com Pollock e cols.9, existe um receio sobre a prescrição e execução de TR, devido a possibilidade de acidente vascular cerebral ou eventos cardíacos. Por outro lado, em normotensos, Ciolac e Guimarães10 indicam que não há nenhuma justificativa para temer a implementação de TR, contanto que se observe os efeitos negativos sobre a pressão sanguínea antes da execução do TR. Além disso, o treinamento resistido dinâmico agudo em ratos espontaneamente hipertensos diminuiu a PA de repouso e a reatividade para PHE e aumentou o relaxamento dependente do endotélio11,12 porém, o efeito crônico do TR na PA, reatividade vascular e morfologia ainda não foram documentados. Assim, o objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos crônicos do TR sobre a pressão arterial, reatividade vascular e alterações no diâmetro luminal arterial de ratos hipertensos induzidos por L-NAME.

Métodos

Animais

Trinta ratos Wistar machos (200 - 250 g) foram obtidos a partir da colônia de procriação da Universidade Federal de Sergipe. Os animais foram alojados em número de quatro animais por caixa em condições de temperatura controlada (22 ± 2 ºC) e ciclo de luz claro-escuro de 12 horas; comida e água foram fornecidas ad libitum. Os animais receberam água filtrada e foram alimentados com ração específica para roedores (Labina, Purina®, Paulínia-SP, Brasil). Todos os procedimentos descritos no presente trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Sergipe, Brasil (protocolo número 02/2010). Os animais foram arrumados em 3 grupos de 10 animais cada: normotenso sedentário (NS), hipertenso sedentário (HS) e hipertenso treinado (HT). Grupos NS e HS foram mantidos nas suas caixas sem exposição ao TR, enquanto que os animais do grupo HT foram submetidos a 4 semanas de TR.

Drogas

Cloreto de acetilcolina (ACh), L-fenilefrina (PHE), Nω-nitro-L-arginina metil éster hidrocloreto (L-NAME) e nitroprussiato de sódio (SNP) foram aplicados no presente estudo, todos obtidos da SIGMA-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA).

Medidas da pressão arterial

A pressão arterial do animal foi obtida ao acordar e 48 horas após a indução e períodos de exercício. Os animais foram adaptados por três dias antes da medição da pressão sanguínea. As pressões arterial média sistólica e diastólica foram determinadas pelo método manguito de cauda (tail-cuff method) (LETICA, LE5002, Barcelona, Espanha). Os animais foram colocados numa câmara de aquecimento a uma temperatura de 38 - 40 ºC por 10 min e os valores da pressão arterial de cada animal (10 - 15) foram registrados.

Indução e manutenção de hipertensão

Durante o período de indução, os animais receberam L-NAME na água de beber, numa concentração de 0,4 mg / ml representando uma ingestão diária de 40 mg / kg13 por quatro semanas14. Durante o período experimental, a HA foi mantida através da administração de L-NAME dissolvido em água para acumular uma ingestão diária de 25 mg/Kg durante quatro semanas, o suficiente para manter o estado hipertensivo. A concentração de L-NAME foi diariamente ajustada para o consumo de água e peso total dos animais em cada caixa.

Protocolo de Treinamento

O protocolo de treinamento foi iniciado após a detecção da hipertensão. O TR foi cumprido em um aparelho de treinamento de agachamento seguindo um modelo adaptado de Tamaki e cols.15. Os animais do grupo HT, após uma semana de adaptação, foram exercitados por três séries de dez repetições com um período de descanso de 60s a uma carga de exercício de 50% estabelecida por um teste máximo de repetição (1RM), três vezes por semana. A carga de treinamento e intensidade foram ajustadas a cada duas semanas através de um 1RM novo.

Parâmetros de estimulação elétrica foram cumpridos, conforme descrito por Baraúna e cols.16 e Pinter e cols.17. Os animais foram estimulados a realizar a série através da aplicação de estímulo elétrico (20 V, 0,3 s de duração, intervalos de 3 s) por eletrodos (ValuTrode, Modelo CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, EUA) ligados a cauda e conectados a um eletro-estimulador (BIOSET, Physotonus Four, Modelo 3050, Rio Claro, SP, Brasl).

Estudos in vitro

Após o sacrifício dos animais a artéria mesentérica superior foi removida, limpa de tecido conectivo e de tecidos gordurosos e seccionada em anéis (1-2 mm). Os anéis foram suspensos pelos ganchos finos de aço inoxidável ligados a um transdutor de força (Letica, Modelo TRI210; Barcelona, Espanha) com fios de algodão em banhos de órgãos contendo 10 ml de solução de Tyrode (Composição em mM: NaCl 158.3, KCl 4.0, CaCl2 2.0, NaHCO3 10.0, C6H12O6 5.6, MgCl2 1.05 e NaH2PO4 0.42). Esta solução foi continuamente gaseificada com solução de carbogênio (95% O2 e 5% CO2) e mantida a 37 ºC sob tensão de descanso de 0,75 g por 60 min (período de estabilização). Durante este período, a solução nutritiva foi trocada a cada 15 minutos, para evitar a interferência de metabolitos18. A tensão isométrica foi registrada através do transdutor de força (TR1210, Letica, Barcelona, Espanha) acoplada a um gravador-amplificador (BD-01, AVS, SP, Brasl).

Quando necessário, o endotélio foi removido esfregando suavemente a superfície íntima dos vasos com um fino fio de aço inoxidável e a sua funcionalidade foi avaliada pela capacidade do ACh (1 µM) induzir mais de 75% de relaxamento Fen (1 µM) no tono. A ausência de relaxamento para ACh foi considerada como evidência de que os anéis foram funcionalmente despidos de endotélio19. Mudanças na reatividade vascular foram avaliadas obtendo-se curvas concentração-resposta para os agentes contrativos Fen (10-8 - 10-3 M), um agonista α1-adrenérgico, e o agente relaxante NPS (10-9 - 10-4 M), um doador de óxido nítrico (NO). Agentes relaxantes foram testados em anéis pré-contraídos com Fen (1 µM).

Exame histológico dos tecidos

Três anéis de cada artéria foram imersos em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada de fosfato (PBS) 0,1 M pH 7,4 e mantidos a 4 ºC durante 24 horas. Os anéis foram enxaguados em água destilada e mantidos em etanol a 70% durante 12 horas e seguido de acordo com protocolo histológico padrão.

Seções com 5-6 µm de espessura foram obtidas usando um micrótomo e montadas em lâminas revestidas com gelatina. Para a análise morfológica, as seções foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) para posterior observação em microscopia de campo próximo.

Análise arterial estereológica foi realizada por meio de um teste de área que compreende um sistema de pontos equidistantes, com um total de 1000 µm2 realizado no programa Image J. Duas secções aleatórias e não consecutivas de cada anel arterial (04 animais por grupo) foram analisadas através da sobreposição de imagens da área de teste, e da seção arterial. O número total de pontos da área de interesse foi estimado. Foi considerado o sentido periferia-centro, incluindo lúmen da artéria e parede arterial (camada íntima e média). A camada adventícia foi descartada, porque havia incongruência na definição dos limites para o tecido de suporte adjacente. Assim, estimou-se a área total da secção da artéria, a área seccional do lúmen do vaso, e a área seccional da parede arterial, permitindo o cálculo das zonas de densidade do lúmen arterial e da parede arterial durante a referência completa.

Análise estatística

Os valores são expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A potência dos experimentos in vitro foi expressa em valores de pD2 e calculada pelo logaritmo negativo de EC50 (concentração eficaz capaz de induzir 50% da resposta máxima), obtido por meio de regressão não linear de curvas concentração-resposta. Quando necessário, o teste t de Student, ou ANOVA de medidas repetidas seguidas de pós-teste Bonferroni foram realizados para avaliar a significância das diferenças entre as médias. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05. O programa estatístico GraphPad PrismTM versão 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) foi usado para todos esses procedimentos.

Resultados

Efeitos do tratamento com L-NAME no peso corporal e sobre a pressão arterial durante o período de indução

Ratos tratados por L-NAME pareceram geralmente saudáveis e com ganho de peso semelhante ao dos ratos não tratados. L-NAME aumentou significativamente PAM, PAS e PAD (p < 0,001). Não houve aumento significativo de níveis da pressão arterial no grupo não tratado (controle). (Tabela 1).

Efeitos do treinamento resistido no peso corporal e valores de pressão arterial em ratos hipertensos

Os animais NS e os grupos HS mostraram um aumento significativo (p < 0,001 e p < 0,05, respectivamente) de peso corporal durante as 4 semanas de tratamento. No entanto, o peso corporal do grupo HT não se alterou após o treinamento. L-NAME elevou a PAM, PAS e PAD no grupo HS, durante o período experimental. No entanto, o TR foi capaz de prevenir este aumento. Antes do protocolo de treinamento não houve diferenças significativas na PAM, PAS e PAD entre os grupos HT e HS. Depois de quatro semanas de treinamento, o TR reduziu significativamente a PAM (p < 0,05) e PAD (p < 0,05) (Tabela 2).

Efeito do treinamento resistido sobre a resposta à fenilefrina

A fenilefrina foi capaz de induzir a contração dos anéis de todos os grupos. A curva de concentração-resposta à fenilefrina foi significativamente deslocada para a esquerda no grupo HS (pD2 = 5,35 ± 0,07, n = 9) em relação ao grupo NS (pD2 = 4,36 ± 0,04, n = 6), com a mudança no Rmax. TR inverteu significativamente o aumento da potência, uma vez que a sua curva de concentração-resposta à fenilefrina foi significativamente (p < 0,001) deslocada para a direita (pD2 = 4,36 ± 0,10, n = 9) em comparação com HS (pD2 = 5,35 ± 0,07; n = 9), sem diferença no Rmax (Figura 1).

Efeito do treinamento resistido sobre a resposta ao nitroprussiato de sódio

A curva concentração-resposta à NPS foi significativamente deslocada para a direita no grupo HS (pD2 = 4,85 ± 0,14, n = 3) em relação ao grupo NS (pD2 = 6,18 ± 0,13, n = 3), sem diferença na Rmax. TR reverteu parcialmente à diminuição da potência, uma vez que a sua curva de concentração-resposta para SNP foi significativamente (p < 0,01) deslocada para a esquerda (pD2 = 5,42 ± 0,06, n = 3) do que em comparação com HS (pD2 = 4,85 ± 0,14; n = 3). Além do mais, o Rmax do grupo HT foi significativamente maior (p < 0,05) do que o grupo HS (Figura 2).

Efeito do treinamento resistido sobre a morfologia vascular

Análise dos segmentos arteriais demonstrou disposição padrão para camadas íntima, média e adventícia em todos os grupos (NS, HS, HT) (Figura 3 A-D). Endotélio na túnica íntima consistiu em tecido epitelial escamoso simples (Figura 3B), suportado por um tecido conjuntivo frouxo disperso na camada subendotelial, seguido pela membrana elástica interna, que separa a túnica intima da túnica média. Na túnica média, havia camadas concêntricas de fibras musculares lisas entremeadas por fibras elásticas (Figura 3B). Observou-se também a presença da membrana elástica externa, que delimita a túnica média da túnica adventícia. A túnica adventícia foi constituída por tecido conjuntivo frouxo (Figura 3B) com colágeno e fibras elásticas, vasos sanguíneos e células de gordura esparsas.

Resultados estereológicos não demonstraram nenhuma diferença significativa no lúmen, túnica média e a área total das artérias dos grupos HS e HT em relação ao grupo NS. A razão parede/lúmen das artérias do grupo HS (p <0,05) foi significativamente diferente da do grupo NS (Tabela 3).

Discussão

O principal objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos cardiovasculares promovidos pelo TR em ratos hipertensos induzidos por L-NAME. O presente estudo mostrou que o TR é eficaz na prevenção do aumento dos níveis de pressão arterial em ratos hipertensos induzidos por L-NAME, possivelmente alterando a sensibilidade do receptor α1-adrenérgico.

Está bem estabelecido na literatura que a síntese e a disponibilidade de óxido nítrico (NO) pelas células endoteliais desempenham um papel importante no relaxamento dos vasos e, assim, contribuem para a modulação do tono vascular. Além disso, o NO foi identificado como um agente importante na proliferação de células do músculo liso20.

Reporta-se também que a inibição crônica da síntese de NO por L-NAME, e consequentemente a disponibilidade diminuída de NO, provoca um aumento na pressão sanguínea arterial21,22, reduz o diâmetro interno arterial, aumenta a resposta aos componentes dos fatores contráteis derivados do endotélio e aumenta a resistência periférica13, causando remodelagem vascular e disfunção do endotélio21. Devido a isso, o método de hipertensão induzida por L-NAME tem sido usado como um modelo confiável para estudos morfológicos e funcionais do sistema cardiovascular.

No nosso estudo, o L-NAME foi capaz de induzir a hipertensão. O aumento da pressão arterial induzida por L-NAME foi inibido nos animais submetidos ao TR. Além disso, o TR não foi capaz de reduzir o ganho de peso dos animais hipertensos. Este resultado está de acordo com aquele encontrado por Baraúna e cols.16, que observaram uma redução de 14% em PAD e 13% no PAM de ratos normotensos e, Tamaki e cols.15 que demonstraram que TR durante 4 semanas não alterou o ganho de peso nos animais.

Há evidências de que tanto o treinamento agudo como crônico reduz significativamente a pressão arterial em humanos23,24 e em ratos hipertensos11, mas pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nesta redução25.

Relatos na literatura indicam que o treinamento físico (TR) tem uma relação muito forte com a função vascular sendo capaz de modificar a estrutura e função vascular das células26. Estudos sugerem que o TR aumenta o fluxo sanguíneo e, portanto, o estresse na parede vascular, fornecendo um aumento na produção de NO derivada do endotélio, daí melhorando a resposta vasodilatadora27,28.

Por conseguinte, a fim de melhor compreender o possível mecanismo envolvido no controle da pressão sanguínea arterial promovida pelo TR em ratos hipertensos induzidos por L-NAME, investigamos os efeitos do TR na reatividade vascular e morfologia desses animais.

Em primeiro lugar, foi avaliada a receptividade contrátil vascular para Fen, um agonista a1-adrenérgico. Os resultados mostraram que a sensibilidade de receptores a1-adrenérgico foi significativamente aumentada em ratos hipertensos induzidos por L-NAME. Resultados semelhantes foram encontrados também por Sekiguchi29, que demonstrou um aumento nos efeitos para Fen em diferentes leitos vasculares de animais treinados com natação forçada.

Curiosamente, em nosso estudo, o efeito Fen nos anéis arteriais de ratos hipertensos induzidos por L-NAME tratados com TR foi reduzido. Nosso estudo relatou que o TR é capaz de induzir ajustamento em função da distribuição do fluxo sanguíneo30. Além do mais, de acordo com Convertino31, mudanças na sensibilidade desses receptores pode ser principalmente dependente da intensidade, duração e frequência do exercício. Embora mais experimentos sejam necessários para esclarecer os mecanismos pelos quais TR promove alterações vasculares, este estudo pode sugerir que as alterações causadas por TR sobre a hemodinâmica de animais treinados possam estar relacionadas a uma sensibilidade reduzida dos receptores adrenérgicos.

Para avaliar a resposta relaxante vascular, usamos o NPS, um doador de NO que imitam uma resposta endógena relacionada ao NO. Esta série de experimentos revelou que a sensibilidade da via NO foi significativamente diminuída em ratos hipertensos induzidos por L-NAME e o TR foi capaz de reverter parcialmente este efeito. Packer32 demonstrou que o bloqueio da produção de NO, tal como ocorre quando se utiliza L-NAME, reduz a expressão de eNOS. Além disso, relata-se também que o fator constritivo derivado do endotélio (FCDE) pode ter a sua saída aumentada, na presença de L-NAME em artérias22 periféricas.

A razão parede/lúmen das artérias é aumentada devido à redisposição da camada média do lúmen do vaso33. Nossos resultados mostraram aumento da razão parede/lúmen das artérias do grupo HS, mas o protocolo TR usado não causou mudanças significativas na redução desta proporção. Melo e cols.34 encontraram um resultado semelhante para mostrar que o exercício aeróbico em intensidade de 50% em SHR diminuiu PAM e a razão parede/lúmen das artérias quando comparada com o grupo sedentário, provando que o treinamento anaeróbio pode ser uma possível terapia anti-hipertensiva adjuvante. Isto reforça a importância dos estudos sobre os efeitos de TR como uma terapia preventiva ou de recuperação da hipertensão arterial, uma vez que mostra não só ser eficaz em impedir a alteração da pressão arterial, como também para proteger as alterações vasculares no modelo de hipertensão induzida por L-NAME.

Concluímos que o treinamento resistido crônico sob as condições testadas neste estudo é capaz de prevenir um aumento da pressão arterial. Este efeito parece envolver um mecanismo que envolve a regulação vasoconstritora e manutenção do diâmetro luminal de ratos hipertensos induzidos por L-NAME.

Agradecimentos

Este trabalho recebeu apoio do CNPq e FAPITEC, Brasil.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq, CAPES, FAPITEC e UFS.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Ayslan Jorge Santos de Araujo pela Universidade Federal de Sergipe.

Correspondência:

Márcio Roberto Viana Santos

Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão

Av. Marechal Rondon s/n, Roza Elze

CEP 49100-000, São Cristovão, Sergipe - Brasil

E-mail:

marcio@infonet.com.br

Artigo recebido em 16/05/12; revisado em 19/10/12; aceito em 08/11/12.

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BACKGROUND: Arterial hypertension is a multifactorial chronic condition caused by either congenital or acquired factors. OBJECTIVE: To evaluate the effects of Resistance Training (RT) on arterial pressure, and on vascular reactivity and morphology, of L-NAME-treated hypertensive rats. METHODS: Male Wistar rats (200 - 250 g) were allocated into Sedentary Normotensive (SN), Sedentary Hypertensive (SH) and Trained Hypertensive (TH) groups. Hypertension was induced by adding L-NAME (40 mg/Kg) to the drinking water for four weeks. Arterial pressure was evaluated before and after RT. RT was performed using 50% of 1RM, 3 sets of 10 repetitions, 3 times per week for four weeks. Vascular reactivity was measured in rat mesenteric artery rings by concentration-response curves to sodium nitroprusside (SNP); phenylephrine (PHE) was also used for histological and stereological analysis. RESULTS: Resistance training inhibited the increase in mean and diastolic arterial pressures. Significant reduction was observed in Rmax (maximal response) and pD2 (potency) of PHE between SH and TH groups. Arteries demonstrated normal intima, media and adventitia layers in all groups. Stereological analysis demonstrated no significant difference in luminal, tunica media, and total areas of arteries in the SH and TH groups when compared to the SN group. Wall-to-lumen ratio of SH arteries was significantly different compared to SN arteries (p<0.05) but there was no difference when compared to TH arteries. CONCLUSIONS: RT was able to prevent an increase in blood pressure under the conditions in this study. This appears to involve a vasoconstrictor regulation mechanism and maintenance of luminal diameter in L-NAME induced hypertensive rats.

 Hypertension Exercise Rats Arterial Pressure Vasodilatation

Ayslan Jorge Santos de AraujoI; Anne Carolline Veríssimo dos SantosI; Karine dos Santos SouzaII; Marlúcia Bastos AiresII; Valter Joviniano Santana-FilhoIII; Emerson Ticona FiorettoII; Marcelo Mendonça MotaI; Márcio Roberto Viana SantosI

IDepartamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Sergipe - Brasil

IIDepartamento de Morfologia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Sergipe - Brasil

IIIDepartamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Sergipe - Brasil

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ABSTRACT

BACKGROUND: Arterial hypertension is a multifactorial chronic condition caused by either congenital or acquired factors.

OBJECTIVE: To evaluate the effects of Resistance Training (RT) on arterial pressure, and on vascular reactivity and morphology, of L-NAME-treated hypertensive rats.

METHODS: Male Wistar rats (200 - 250 g) were allocated into Sedentary Normotensive (SN), Sedentary Hypertensive (SH) and Trained Hypertensive (TH) groups. Hypertension was induced by adding L-NAME (40 mg/Kg) to the drinking water for four weeks. Arterial pressure was evaluated before and after RT. RT was performed using 50% of 1RM, 3 sets of 10 repetitions, 3 times per week for four weeks. Vascular reactivity was measured in rat mesenteric artery rings by concentration-response curves to sodium nitroprusside (SNP); phenylephrine (PHE) was also used for histological and stereological analysis.

RESULTS: Resistance training inhibited the increase in mean and diastolic arterial pressures. Significant reduction was observed in Rmax (maximal response) and pD2 (potency) of PHE between SH and TH groups. Arteries demonstrated normal intima, media and adventitia layers in all groups. Stereological analysis demonstrated no significant difference in luminal, tunica media, and total areas of arteries in the SH and TH groups when compared to the SN group. Wall-to-lumen ratio of SH arteries was significantly different compared to SN arteries (p<0.05) but there was no difference when compared to TH arteries.

CONCLUSIONS: RT was able to prevent an increase in blood pressure under the conditions in this study. This appears to involve a vasoconstrictor regulation mechanism and maintenance of luminal diameter in L-NAME induced hypertensive rats.

Keywords: Hypertension / physiopathology; Exercise; Rats; Arterial Pressure / drug effects; Vasodilatation / physiology.

Introduction

Arterial hypertension (AH) is a multifactorial chronic condition1, caused by either congenital or acquired factors2. Its treatment involves pharmacological and non-pharmacological methods3. Among non-pharmacological methods, physical training (PT) has been one of the most important interventions indicated for preventing or controlling AH4,5.

There is a positive relationship between hypertension and sedentary lifestyle6. Beunza et al6 demonstrated that the interaction of sedentary behaviors, such as driving and computer use, was associated with a higher risk of hypertension. On the other hand, the noninteractive subtype, such as television viewing and sleeping, was not associated with AH. This data shows the great importance of long-term PT for the primary prevention and treatment of high blood pressure4.

Many studies have focused on the effects of aerobic exercise2-5, and it has been recommended as an adjuvant treatment for hypertension; however, knowledge regarding the benefits of resistance training (RT) has been increasing. Positive effects of long-term RT, such as increased skeletal muscle tone, inhibition of risk factors and prevention of obesity have been found7. Studies suggest the adoption of a moderate strength training program and assert that it can have a positive effect on chronically increased BP8.

According to Pollock et al9, there is some trepidation about the prescription and implementation of RT due to the possibility of vascular brain or cardiac events. On the other hand, in normotensive individuals, Ciolac and Guimarães10 indicate that there is no justification for fearing RT implementation as many negative effects on blood pressure before the execution of RT have been observed. Furthermore, acute dynamic resistance exercise in spontaneously hypertensive rats decreased resting BP and reactivity to PHE, in addition to increasing endothelium-dependent relaxation11,12; however, the long-term effect of RT on BP and reactivity and morphology of the vasculature have not yet been documented. Thus, the purpose of the present study was to determine the chronic effects of RT on arterial blood pressure, vascular reactivity and changes in arterial luminal diameter of L-NAME-treated hypertensive rats.

Methods

Animals

Thirty male Wistar rats (200 - 250 g) were obtained from the breeding colony at the Sergipe Federal University. Animals were housed four to a cage under controlled temperature conditions (22 ± 2 ºC) and a light-dark cycle of 12 hours. Food and water were provided ad libitum. The animals received filtered water and were fed rodent-specific food (Labina, Purina®, Paulínia-SP, Brazil). All procedures described in the present study were approved by the Animal Research Ethics Committee of Sergipe Federal University, Brazil (Protocol number 02/2010). Animals were arranged into three groups with ten animals each: sedentary normotensive (SN), sedentary hypertensive (SH) and training hypertensive (TH). SN and SH groups were kept in their cages without undergoing RT, while animals in TH group were subjected to four weeks of RT.

Drugs

Acetylcholine chloride (ACh), L-phenylephrine (Phe), Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) and sodium nitroprusside (SNP) were utilized in this study, all obtained from SIGMA-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)

Blood pressure measurements

Blood pressure was obtained upon the animal awakening and 48 hours after the induction and training periods. Animals were allowed to adapt to the environment for three days before the measurement of blood pressure. Mean, systolic and diastolic blood pressures were determined by tail cuff method (LETICA, LE5002, Barcelona, Spain). Animals were placed in a heated chamber at a temperature of 38 - 40 ºC for ten minutes and blood pressure values (10-15) were recorded from each animal.

Hypertension induction and maintenance

During the induction period, the animals were given L-NAME in their drinking water at a concentration of 0.4 mg/ml for a total daily intake of 40 mg/kg13 for four weeks14. During the experimental period, AH was maintained by the administration of L-NAME dissolved in water to accumulate a daily intake of 25 mg/Kg for a duration of more than four weeks, which was sufficient to maintain the hypertensive state. The concentration of L-NAME was adjusted daily for water consumption and total weight of the animals in each cage.

Training protocol

The training protocol was initiated after detection of hypertension in the subjects. RT was performed in a squat-training apparatus following a model adapted from Tamaki et al15. TH animals, following one week of adaptation, were trained with three sets of ten repetitions with a 60 second resting period at a 50% training load set by one repetition maximum test (1RM), three times per week. The training load and intensity were adjusted every two weeks with a new 1RM.

Parameters of electrical stimulation were fulfilled as described by Barauna et al16 and Pinter et al17. Animals were encouraged to perform the series through the application of electrical stimulation (20 V, 0.3 s duration, 3 s intervals) with electrodes (ValuTrode, Model CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, USA) attached at the tail and connected to an electrostimulator (BIOSET, Physiotonus Four, Model 3050, Rio Claro, SP, Brazil).

In vitro studies

Following animal sacrifice the superior mesenteric artery was removed, stripped of connective and fatty tissues and sectioned into rings (1-2 mm). Rings were suspended from fine stainless steel hooks, connected to a force transducer (Letica, Model TRI210; Barcelona, Spain) with cotton threads in organ baths containing 10 ml of Tyrode's solution (composition in mM: NaCl 158.3, KCl 4.0, CaCl2 2.0, NaHCO3 10.0, C6H12O6 5.6, MgCl2 1.05 and NaH2PO4 0.42). This solution was continually gassed with carbogen (95% O2 and 5% CO2) and maintained at 37 ºC under a resting tension of 0.75 g for 60 minutes (stabilization period). During this time, the nutrient solution was changed every 15 minutes to prevent the interference of metabolites18. Isometric tension was recorded through the force transducer (TRI210, Letica, Barcelona, Spain) coupled with an amplifier-recorder (BD-01, AVS, SP, Brazil).

When necessary, endothelium was removed by gently rubbing the intimal surface of the vessels with a fine stainless wire; its functionality was assessed by the ability of ACh (1 µM) to induce more than 75% relaxation of Phe (1 µM) tonus. The absence of relaxation in reaction to ACh was taken as evidence that the rings were functionally denuded of endothelium19. Changes in vascular reactivity were assessed by obtaining concentration-response curves for the contractile agents Phe (10-8 - 10-3 M), an α1-adrenergic agonist; and the relaxant agent SNP (10-9 - 10-4 M), a donor nitric oxide (NO). Relaxing agents were tested on rings pre-contracted with Phe (1 µM).

Histological examination of tissues

Three rings from each artery were immersed in a 4% paraformaldehyde in phosphate-buffered saline (PBS; 0.1 M pH 7.4) and kept at 4 ºC for 24 hours. Rings were then rinsed in distilled water and kept in 70% ethanol for 12 hours, followed by standard histological protocol.

Sections of 5-6 µm thickness were obtained using a microtome and were mounted on slides coated with gelatin. For morphological analysis, sections were stained with hematoxylin and eosin (H.E) for further observation under bright field microscopy.

Arterial stereological analysis was performed by using a test-area comprising a system of equidistant points containing a total of 1000 µm2 performed in the Image J program. Two random and non-consecutive sections of each arterial ring ( four animals per group) were analyzed by overlaying images of test-area and the arterial section. The number of total points falling into the area of interest was estimated. A periphery to the center direction was considered, including artery lumen and arterial wall (intima and tunica media). The adventitia layer was discarded because there was incongruity in the definition of the limits of the supportive adjacent tissue. Thus, the total sectional area of the artery, the sectional area of the lumen of the vessel and the sectional area of the arterial wall were estimated, allowing the calculation of density areas of the arterial lumen and arterial wall over the full reference.

Statistical analysis

Values are expressed as mean ± standard error of mean (SEM). The potency of the in vitro experiments were expressed in pD2 values and calculated by the negative logarithm of EC50 (effective concentration able to induce 50% of maximal response) obtained by nonlinear regression of concentration-response curves. When necessary, Student's t test or ANOVA repeated measures followed by Bonferroni post-test were performed to evaluate the significance of differences between means. Values were considered statistically significant when p < 0.05. For all of these procedures we used the statistical program GraphPad PrismTM version 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Results

Effects of treatment with L-NAME on body weight and blood pressure during the induction period

L-NAME-treated rats appeared generally healthy and gained weight similarly to the untreated rats. L-NAME significantly increased MAP, SBP and DBP (p < 0.001). There was no significant elevation of blood pressure levels in the untreated group (control) (Table 1).

Effects of resistance training on body weight and blood pressure values in hypertensive rats

The animals in the SN and SH groups showed a significant increase (p<0.001 and p<0.05 respectively) in body weight at four weeks of treatment. However, the body weight of the TH group was unchanged following training. L-NAME elevated the MAP, SBP and DBP in the SH group during the experimental period. However, RT was effective in preventing this increase. Before the training protocol there were no significant differences in MAP, SBP and DBP between the TH and SH groups. After four weeks of training, RT significantly reduced MAP (p < 0.05) and DBP (p < 0.05) (Table 2).

Effect of resistance training on the response to phenylephrine

Phenylephrine was able to induce contraction in the rings from all groups. The concentration-response curve to phenylephrine was significantly shifted to the left in the H group (pD2 = 5.35 ± 0.07, n = 9) in relation to the SN group (pD2 = 4.36 ± 0.04, n = 6) with change in Rmax. RT significantly reversed the increase in the potency, since its concentration-response curve to phenylephrine was significantly (p < 0.001) shifted to the right (pD2 = 4.36 ± 0.10, n = 9) compared to SH (pD2 = 5.35 ± 0.07, n = 9), without change in Rmax (Figure 1).

Effect of resistance training on the response to sodium nitroprusside

The concentration-response curve to SNP was significantly (p < 0.05) shifted to the right in the SH group (pD2 = 4.85 ± 0.14; n = 3) in relation to the SN group (pD2 = 6.18 ± 0.13; n = 3) without change in Rmax. RT partially reversed the decrease in the potency, since its concentration-response curve to SNP was significantly (p < 0.01) shifted to the left (pD2 = 5.42 ± 0.06; n = 3) compared to SH (pD2 = 4.85 ± 0.14; n = 3). Furthermore, the Rmax of TH group was significantly (p < 0.05) larger than SH group (Figure 2).

Effect of resistance training on vascular morphology

Analysis of arterial segments demonstrated a standard arrangement of intima, media and adventitia layers in all groups (SN, SH, TH) (Figure 3 A-D). Endothelium in the tunica intima consisted of simple squamous epithelial tissue (Figure 3B) supported by loose connective tissue scattered in the subendothelial layer, followed by the internal elastic membrane that separates the tunica intima from the tunica media. In the tunica media, there were concentric layers of smooth muscle fibers intermingled with elastic fibers (Figure 3B). The presence of the external elastic membrane was also noted, which delimits the tunica media from the tunica adventitia. The tunica adventitia was comprised of loose connective tissue (Figure 3B) with collagen and elastic fibers, blood vessels and sparse fat cells.

Stereological results demonstrated no significant difference in the lumen, tunica media and the total area of the arteries of SH and TH groups in relation to SN group. The wall-to-lumen ratio of the arteries of SH group (p < 0.05) was significantly different from SN group (Table 3).

Discussion

The main purpose of this study was to evaluate the cardiovascular effects of RT on L-NAME hypertensive rats. The current study showed that RT is effective in preventing an increase in blood pressure levels in L-NAME hypertensive rats, possibly by changing the α1-adrenergic receptor sensibility.

It is well established in the literature that the synthesis and the availability of nitric oxide (NO) by endothelial cells play an important role in vasorelaxation, thus contributing to the modulation of vascular tone. Furthermore, NO has been identified as an important agent in the proliferation of smooth muscle cells20.

It is also known that the chronic inhibition of NO synthesis by L-NAME, and the consequent decreased availability of NO, causes an increase in arterial blood pressure21,22, reduces the internal arterial diameter, increases response to components of the endothelium-derived contracting factors, increases peripheral resistance13 and causes vascular remodeling and endothelial dysfunction21. Because of this, the L-NAME-induced hypertension method has been used as a reliable model for morphological and functional studies of the cardiovascular system.

In our study, L-NAME was able to induce hypertension. The increase in arterial pressure induced by L-NAME was inhibited in the animals that underwent RT. Furthermore, RT was not able to reduce the weight gain of the hypertensive animals. This result is in agreement with a study by Barauna et al16, in which a reduction of 14% in DBP and 13% in MAP of normotensive rats was observed, and a study by Tamaki et al15, which demonstrated that RT for four weeks did not alter weight gain of animals.

There is evidence that both short and long-term physical training significantly reduces blood pressure in humans23,24 and in hypertensive rats11, but little is known about the mechanisms involved in this reduction25.

Reports in the literature indicate that physical training (PT) has a very strong relationship with vascular function, being able to modify the structure and function of vascular cells26. Studies suggest that PT increases blood flow and therefore the stress on the vascular wall, providing an increase in endothelium-derived NO production and thereby improving the vasodilator response27,28.

Therefore, in order to better understand the possible mechanism involved in arterial blood pressure control promoted by RT in L-NAME hypertensive rats, we investigated the effects of RT on the vascular reactivity and morphology of these animals.

First, we evaluated the vascular contractile response to Phe, an α1-adrenergic agonist. The results showed that the sensitivity of α1-adrenergic receptors was significantly increased in L-NAME hypertensive rats. Similar results were also found by Sekiguchi29, who demonstrated an increase in the effects of PHE on different vascular beds from animals subjected to forced swimming.

Interestingly in our study, the PHE effect on arterial rings from L-NAME hypertensive rats treated with RT was reduced. It is possible that RT is able to induce an adjustment in the blood flow distribution30. Furthermore, according to Convertino31, changes in the sensitivity of these receptors may be primarily dependent on the intensity, duration and frequency of the exercise. Although more experiments are needed to clarify the mechanisms by which RT promotes vascular changes, this study suggests that the changes caused by RT on the hemodynamics of trained animals could be related to a reduced sensitivity of adrenergic receptors.

To evaluate the vascular relaxant response, we used SNP, a NO donor that mimics an endogenous response related to NO. This set of experiments revealed that the sensitivity of the NO pathway was significantly decreased in L-NAME hypertensive rats and that RT was able to partially reverse this effect. Packer32 demonstrated that blocking NO production, such as occurs when using L-NAME, reduces the eNOS expression. Furthermore, it is possible that the output of endothelium-derived constricting factor (EDCF) increases in the presence of L-NAME in peripheral arteries22.

The wall-to-lumen ratio of the arteries is increased due to rearrangement of the medial layer of the vessel lumen33. Our results showed an increase of the wall-to-lumen ratio in the arteries of SH group, but the RT protocol used did not cause significant changes in the reduction of this ratio. Melo et al34 found a similar result when they showed that aerobic training at 50% intensity in SHR decreased MAP and the wall-to-lumen ratio of the arteries when compared to the sedentary group, proving that anaerobic training can be a possible adjuvant therapy for hypertension. This reinforces the importance of studies on the effects of RT as a preventive or recuperative therapy for hypertension, because it shows that RT is not only effective in preventing changes in blood pressure but may also protect against vascular changes, as shown in the model of L-NAME-induced hypertension.

In conclusion, long-term resistance training, under the tested conditions in this study, is able to prevent an increase in blood pressure. This effect appears to involve a mechanism of vasoconstrictor regulation and maintenance of the luminal diameter in L-NAME- induced hypertensive rats.

Acknowledgements

This work was supported by CNPq and FAPITEC, Brazil.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq, CAPES, FAPITEC and UFS.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Ayslan Jorge Santos de Araujo, from Universidade Federal de Sergipe.

References