FUNDAMENTO: Em estudo anterior, utilizando o modelo de ratos, a exposição à fumaça do cigarro durante 5 semanas aumentou a sobrevida após IAM, apesar da idade similar e tamanho do infarto entre fumantes e não fumantes, e da ausência de reperfusão. OBJETIVO: Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo analisar os efeitos da exposição à fumaça do cigarro sobre a intensidade, distribuição ou fosforilação da conexina 43 no coração de ratos. MÉTODOS: Ratos Wistar, pesando 100 g, foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: 1) Controle (n = 25); 2) Expostos à fumaça do cigarro (ETS), n = 23. Depois de 5 semanas, foram conduzidas análise morfométrica do ventrículo esquerdo, imuno-histoquímica e Western blot para conexina 43 (Cx43). RESULTADOS: A fração do volume de colágeno, as áreas transversais e o peso ventricular não foram estatisticamente diferentes entre os grupos controle e ETS. O grupo ETS apresentou uma coloração de menor intensidade da Cx43 em discos intercalados (Controle: 2,32 ± 0,19; ETS: 1,73 ± 0,18; p = 0,04). A distribuição da Cx43 em discos intercalados não diferiu entre os grupos (Controle: 3,73 ± 0,12; ETS: 3,20 ± 0,17; p = 0,18). Os ratos do grupo ETS mostraram um nível maior de forma desfosforilada da Cx43 (Controle: 0,45 ± 0,11; ETS: 0,90 ± 0,11; p = 0,03). Por outro lado, o Cx43 total não diferiu entre os grupos de controle e ETS (Controle: 0,75 ± 0,19; ETS: 0,93 ± 0,27; p = 0,58). CONCLUSÃO: A exposição à fumaça do cigarro resultou na remodelação das junções comunicantes cardíacas, caracterizada por alterações na quantidade e fosforilação da Cx43 em corações de ratos. Essa constatação pode explicar o paradoxo dos fumantes observado em alguns estudos.
ARTIGO ORIGINAL
EXPERIMENTAL
IFaculdade de Medicina de Botucatu
IIInstituto de Biociências de Botucatu, Botucatu, SP - Brasil
Apesar dos dados convincentes sobre os efeitos nocivos do tabagismo, vários estudos relataram baixa mortalidade após infarto agudo do miocárdio (IAM) para fumantes em comparação com não fumantes. Esse fenômeno é conhecido como paradoxo dos fumantes1-4.
Muitas explicações foram propostas para os desfechos mais favoráveis em fumantes após IAM, incluindo: 1) os fumantes serem mais jovens e apresentarem menos comorbidades; 2) possuírem uma maior mortalidade pré-hospitalar; 3) os fumantes possuírem uma maior carga de trombo, o que induz uma maior eficácia da trombólise intravenosa; 4) o efeito semelhante ao pré-condicionante isquêmico ser induzido pela fumaça do cigarro. O pré-condicionamento isquêmico é um fenômeno por meio do qual um breve período de isquemia torna o miocárdio resistente ao infarto a partir de um insulto isquêmico subsequente. O pré-condicionamento isquêmico limita o tamanho do infarto, reduz a incidência de arritmias fatais, e protege contra miocárdio lesado5,6.
Em um estudo anterior, utilizando o modelo de ratos, a exposição à fumaça do cigarro durante 5 semanas aumentou a sobrevida após IAM, a despeito das idades semelhantes e tamanho do infarto entre fumantes e não fumantes, e da ausência de reperfusão. É importante notar que a redução da mortalidade foi observada nas primeiras 24 horas após oclusão coronariana7. Neste modelo, 87% das mortes prematuras foram uma consequência das arritmias ventriculares8. Portanto, presumimos que o efeito paradoxal dos fumantes pode ser resultado de ação semelhante ao pré-condicionamento. No entanto, ainda são desconhecidos os mecanismos potenciais desta proteção induzidos pela exposição à fumaça do cigarro.
A proteção do pré-condicionamento isquêmico depende dos canais funcionais da comunicação intercelular da junção de hiato9. As junções comunicantes no miocárdio correspondem a contatos intercelulares especializados que permitem a propagação do impulso elétrico entre cardiomiócitos. A conexina 43 (Cx43) é a proteína principal da junções comunicantes em ventrículos do coração10 e desempenha um papel importante no pré-condicionamento isquêmico. Este fato é evidenciado pela constatação de que o pré-condicionamento isquêmico não pode induzir uma proteção em camundongos heterozigotos deficientes de Cx4311. No entanto, permanecem desconhecidos os efeitos do tabagismo em Cx-43 cardíaca12. Por isso, para solucionar este problema, testamos a hipótese de que a exposição à fumaça do cigarro possa interferir na intensidade, distribuição ou fosforilação da Cx43 no coração de ratos.
Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais de nossa Instituição (protocolo número 399).
Ratos machos Wistar, pesando 100 g, foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: 1) Grupo de controle (n = 25), ratos de controle sem exposição à fumaça do cigarro; 2) Grupo de expostos à fumaça do cigarro (ETS), n = 23. A exposição à fumaça do cigarro durou 5 semanas.
Os ratos do grupo ETS foram expostos à fumaça de cigarro numa câmara (dimensões 95 x 80 x 65 cm), conectados a um dispositivo de fumaça tendo como base um modelo adaptado de Paiva e cols.7,13-17. A fumaça foi retirada de cigarros comerciais com filtro (composição por unidade: 1,1mg de nicotina, 14 mg de alcatrão e 15 mg de monóxido de carbono) com uma bomba de vácuo, tendo sido expelida dentro da câmara de fumo. Durante a 1ª semana, o número de cigarros foi gradualmente aumentado de 5 para 10 por um período de 30 minutos, por duas vezes, no período da tarde. Durante as próximas 3 a 4 semanas, aproximadamente, até que os ratos atingissem o peso alvo, 10 cigarros foram utilizados em cada ensaio de fumo, que foi repetido 4 vezes/dia, duas vezes durante a manhã e duas vezes no período da tarde. Em um estudo anterior, com um tempo de exposição ao tabaco semelhante, os níveis de carboxihemoglobina nos ratos expostos à fumaça eram maiores do que no grupo de controle (ratos de controle: 0,9 ± 0,7 % e ratos do grupo ETS: 5,3 ± 2,8 %, p = 0,008)14. Dessa forma, o último estudo confirmou a eficácia da exposição dos animais à fumaça de cigarro. Todos os animais eram alimentados com uma dieta na mesma quantidade, que se baseou na ingestão de alimentos do grupo ETS. Depois desse período de exposição à fumaça do cigarro, os ratos foram sacrificados com uma dose excessiva de anestesia (pentobarbital de sódio 100 mg/kg de peso corporal). Os ratos do grupo ETS não foram expostos à fumaça do cigarro durante as 12 horas anteriores à eutanásia.
Quando da conclusão do período de tratamento, os ventrículos direito e esquerdo (incluindo o septo interventricular) foram dissecados, separados e pesados. As seções coronais, com cerca de 3 mm de espessura, feitas a 5 mm da ponta dos ventrículos, foram fixadas em uma solução de formaldeído tamponado a 10% por 48 horas, seguido de imersão em uma solução de álcool a 70% por 48 horas. Após a fixação, os tecidos foram embebidos em parafina. As seções histológicas de quatro e seis micra de espessura foram coradas, respectivamente, com Hematoxilina-eosina (HE) e Picrosirius vermelho colágeno-específico. As áreas transversais de miócitos (MA) foram medidas nas seções coradas com HE por um microscópio LEICA DM LS conectado a uma câmera de vídeo e um computador IBM compatível, equipado com o programa de análise de imagem Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EUA). Cinquenta a setenta células por lâmina foram analisadas. As células selecionadas apresentavam forma circular e estavam localizadas na camada subendocárdica das paredes ventriculares. Esta precaução objetivou otimizar a uniformidade do formato dos miócitos entre os grupos. A área transversal média obtida para cada grupo foi utilizada como um indicador de hipertrofia celular. As lâminas coradas com Picrosirius vermelho foram utilizadas para quantificar a fração de volume do colágeno intersticial por meio de videodensitometria. As imagens do tecido cardíaco foram feitas e analisadas utilizando o sistema descrito acima. Os elementos do tecido cardíaco foram identificados de acordo com o nível de cor. Portanto, as fibras colágenas foram visualizadas em vermelho e os miócitos em amarelo. A fração do volume de colágeno (CVF) foi calculada automaticamente e correspondia à soma das áreas de colágeno dividida pela soma dos tecidos de colágeno e área dos miócitos. Uma média de trinta campos foram analisados utilizando uma lente com uma ampliação de 40X. O colágeno perivascular foi excluído da análise14,16.
Os experimentos de imuno-histoquímica foram realizados de acordo com Saffitz e cols.18 com algumas modificações19. Todos os corações, cortados transversalmente, foram fixados, sucessivamente, em uma solução de formaldeído tamponado a 10% por 24 horas, água corrente por 24 horas e álcool a 70% por 24 horas. Após a fixação, os tecidos foram embebidos em parafina e cortados em seções de 3 µm. Antes da imunomarcação, caracterização tecidual e orientação, houve registro com coloração por hematoxilina-eosina.
As seções (3 µm) foram dispostas em lâminas de vidro revestidas com poli-D-lisina e, sucessivamente, desparafinadas três vezes, durante 5 minutos cada, em banhos de xilol, álcool 100%, álcool 95% e álcool 70%, seguido por rehidratação em água destilada por 10 minutos. Os locais antigênicos foram recuperados por meio do tratamento dos cortes em tampão de ácido cítrico de 0,01M em um tampão fosfato-salino (PBS) com pH 6,0, por 10minutos, em ambiente de micro-ondas. Após este período, os cortes foram mantidos congelados durante 20minutos, seguido por lavagem em PBS com pH de 7,2. As seções foram bloqueadas com solução de albumina de soro bovino (BSA) de 3% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois desse procedimento, as seções foram incubadas durante a noite com anticorpo policlonal de coelho, anti-conexina 43 (Abcam Inc. Cambridge), diluído a 1:100 em BSA a 2%, em PBS a 4 ºC. Na manhã seguinte, as seções foram lavadas em PBS durante 15 minutos, por três vezes e incubadas em um anticorpo secundário (IgG anti-coelho vermelho Texas, Vetor) na diluição de 1:50 em BSA a 2%, em PBS à temperatura ambiente, durante 1 hora.
As seções foram lavadas em PBS durante 15 minutos, por três vezes, e montadas em meio de glicerol. Dez seções foram processadas simultaneamente em cada execução de imunomarcação enquanto controles negativos, nas quais o anticorpo primário foi omitido, com execução rotineira em paralelo20, visando a monitorar qualquer ocorrência de coloração inespecífica. A imunomarcação da Cx43 foi examinada por microscopia de epifluorescência (Carl-Zeiss, Inc. North America), equipada com um cubo de filtro de WG (excitação = 550 nm e emissão = 650 nm), conectado a uma câmara de vídeo e um computador compatível (AxioPlan 4,1; Carl-Zeiss Inc.). Todas as imagens foram registradas no mesmo dia da marcação, e os tecidos foram codificadas e examinados cegamente pela mesma pessoa.
Em cada coração, conforme descrito por Kostin e cols.21, 10 campos óticos tiveram registradas e analisadas a distribuição da Cx43 nos miócitos (ou seja, presença da Cx43 dentro e fora do disco intercalado) e a intensidade da coloração da Cx43 em discos intercalados.
Os experimentos de Western blot foram realizados de acordo com Rolim e cols.22. As amostras foram homogeneizadas em tampão de lise gelado (tampão fosfato de potássio de 50 mM, pH de 7,0, 0,3 mM de sacarose, 0,5 mM de DTT, 1 mM de EDTA, pH de 8,0, 0,3 mM de PMSF, 10 mM de NaF e coquetel inibidores de protease).
O sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 12000 rpm durante 20 minutos e armazenado a -80 ºC. A determinação das proteínas foi realizada por curvas padrão de proteína BSA (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e por meio do método de Bradford. As amostras de proteína foram diluídas em tampão de Laemmli (Tris-HCl 240 mM; 0,8% de SDS; glicerol a 40%; 0,02% de azul de bromofenol e 200 mM de beta-mercaptoetanol). Em seguida, 50 µg de cada amostra foi separada em géis de empilhamento de poliacrilamida a 10% (Tris-HCl 240 mM, pH 6,8; poliacrilamida a 30%; APS e TEMED) e géis separadores (Tris-HCl 240 mM, pH 8,8, 30% de poliacrilamida; APS e TEMED). A eletroforese foi executada em 120 V por 90 minutos.
A transferência para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) foi realizada no sistema Mini-Trans Blot (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), com tampão de transferência (Tris25mM; glicina 192mM, metanol a 20% e 0,1% de SDS) por 90minutos a 120mA. Os blots foram bloqueados com 5% de leite desnatado, durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação e lavagem três vezes com PBS Tween (Tris 1 mM, pH2,8, 5 mM de NaCl e Tween 20). Em seguida, os blots foram imunomarcados durante a noite com um anticorpo primário monoclonal de camundongo anti-Cx43 (Ab11369-Abcam), correspondendo a 130-143 aminoácidos de Cx43 diluídos a 1:250 em PBS Tween (Tris 1mM, pH2,8; NaCl 5 mM e Tween20) ou camundongo monoclonal anti-Cx43 (13-8300-Zymed) diluído a 3µg/mL, específico para serina 368, e resíduo não fosforilado de Cx43.
Na manhã seguinte, as membranas foram lavadas três vezes em PBS Tween (Tris 1mM, pH2,8; 5mM de NaCl e Tween 20). Isso foi acompanhado por incubação de 2 horas à temperatura ambiente com anticorpo anticamundongo conjugado HRP (Sigma) diluído a 1:10000. Depois de enxaguar três vezes em PBS Tween (Tris 1mM, pH2.8; NaCl5mom e Tween20), as membranas foram incubadas por 1 minuto em solução de ECL (Amershan) (
Após este procedimento, as densidades das faixas escuras obtidas foram analisadas por quantificação densitométrica da intensidade do sinal com o software Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, EUA), com as medições de fundo de intensidade de sinal a ser subtraídas individualmente de cada Lane19.
Os dados foram expressos em média ± DP. A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 5%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SigmaStat para Windows v2.03 (SPSS Inc., Chicago, IL).
As variáveis morfométricas não diferiram estatisticamente entre os grupos de controle e ETS (
A exposição à fumaça induziu uma coloração de menor intensidade de Cx43 no disco intercalado quando comparada aos ratos do grupo controle (Controle: 2,32 ± 0,19; ETS: 1,73±0,18; p = 0.04). A distribuição da CX43 em discos intercalados não diferiu entre os ratos do grupo de controle e ETS (Controle: 3,73 ± 0,12; ETS: 3,20 ± 0,17; p = 0,18); (
Os ratos do grupo ETS mostraram valores maiores de forma desfosforilada da Cx43 que os ratos do grupo controle (Controle: 0,45 ± 0,11; ETS: 0,90 ± 0,11; p = 0,03). Por outro lado, o Cx43 total não diferiu entre os grupos controle e ETS (Controle: 0,75 ± 0,19; ETS: 0,93 ± 0,27; p = 0,58); (
O presente estudo teve como objetivo analisar os efeitos da exposição à fumaça do cigarro sobre a intensidade, distribuição ou fosforilação da conexina Cx43 no coração de ratos. Nossos dados indicam que a exposição à fumaça do cigarro induziu a remodelação das junções de hiato cardíacas.
Uma questão importante a ser considerada é que, além dos efeitos já conhecidos sobre o endotélio vascular e os pulmões, os estudos anteriores mostraram que a exposição à fumaça de cigarro por pelo menos dois meses induz a remodelação cardíaca, caracterizada por alterações morfológicas e funcionais. Na verdade, a fumaça produzia aumentos nos diâmetros da sístole diastólica e sistólica do ventrículo esquerdo, induzindo também hipertrofia ventricular esquerda. Essas alterações morfológicas foram associadas com a redução da função sistólica ventricular esquerda7,13,14,16,19,23-27. Entretanto, ainda são desconhecidos os efeitos da exposição à fumaça do cigarro nas junções comunicantes cardíacas.
A principal conclusão do presente estudo foi que a exposição à fumaça do cigarro induz a remodelação das junções comunicantes cardíacas. Com efeito, o processo de remodelação foi caracterizado por uma menor quantidade de Cx43 em discos intercalados e por um aumento na forma não fosforilada da Cx43 no miocárdio.
Outra questão importante é que a remodelação cardíaca começa tipicamente com alterações genéticas, moleculares, celulares, bioquímicas e, em seguida, estruturais28-31. Neste contexto, nossos achados de alteração na Cx43 sem diferenças nas variáveis morfológicas dos ventrículos direito e esquerdo podem ser interpretados como observação de estágio precoce da remodelação cardíaca. Portanto, presumimos que a remodelação da Cx43 precede as alterações morfológicas e funcionais induzidas pela exposição à fumaça do cigarro.
As junções comunicantes são aglomerados de canais transmembrana que ligam os compartimentos citoplasmáticos de células vizinhas. As proteínas do componente de canais de junções comunicantes são denominadas conexinas. Existem diversos tipos de conexinas, mas a isoforma predominante no coração, principalmente no ventrículo, é Cx4310. O principal papel das junções comunicantes no miocárdio é coordenar a excitação elétrica e facilitar a troca intercelular de pequenas proteínas, como as proteínas transdutoras de sinal. É importante notar que as funções normais de junções comunicantes estão relacionadas com a expressão e distribuição normais da Cx43, dado que esta conexina está localizada principalmente no disco intercalado de cardiomiócitos. Além do mais, o grau de fosforilação da Cx43 é essencial para a função da junções comunicantes10.
As alterações na quantidade, localização e fosforilação da Cx43 foram observadas quando o coração era submetido a eventos isquêmicos ou hipóxicos21,32,33 e quando esses eventos são precedidos por pré-condicionamento isquêmico34,35. A referida isquemia leva à redução da junções comunicantes cardíaca, caracterizada por uma menor expressão da Cx4332,36. Dessa forma, as alterações observadas na intensidade da Cx43 provocadas pelo tabagismo no presente estudo são semelhantes àquelas induzidas por isquemia.
No presente estudo, a diminuição da intensidade da coloração da Cx43 em discos intercalados induzida pela exposição à fumaça do cigarro se assemelha aos efeitos do pré-condicionamento isquêmico, que inicia um processo de ocorrência de Cx43 na membrana plasmática livre, no lado externo dos discos intercalados. Em decorrência deste efeito, o pré-condicionamento isquêmico pode melhorar a possibilidade de sobrevivência celular após isquemia prolongada35.
No que diz respeito ao aumento da forma não fosforilada da Cx43 induzida pela exposição à fumaça do cigarro, diversos estudos demonstram que a desfosforilação da Cx43 causa desacoplamento elétrico nos miócitos cardíacos34 e a inibição da desfosforilação da Cx43 leva a efeitos protetores na função cardíaca durante lesão hipóxica37. Nesse contexto, estudos revelam que os agentes de desacoplamento de junções comunicantes administrados antes da isquemia preservam o acoplamento elétrico dos miócitos cardíacos durante um insulto isquêmico subsequente, de maneira similar ao pré-condicionamento isquêmico38. Esses autores sugerem que o desacoplamento parcial e reversível das junções comunicantes antes da isquemia resultam em um efeito antiarrítmico durante um insulto isquêmico prolongado, de maneira similar ao pré-condicionamento isquêmico.
Nesse contexto, o presente estudo constatou que a exposição à fumaça do cigarro desencadeou um processo de remodelação nas junções comunicantes cardíacas, um efeito semelhante ao pré-condicionamento isquêmico. Portanto, nossos dados sugerem fortemente que a exposição à fumaça do cigarro pode induzir um efeito semelhante ao pré-condicionamento isquêmico no coração de ratos. Com efeito, esse fenômeno pode explicar o paradoxo dos fumantes observado em alguns estudos1-4.
Os mecanismos envolvidos nos efeitos da exposição à fumaça do cigarro sobre as junções comunicantes cardíacas são desconhecidos. Entre os possíveis mecanismos, a remodelação ventricular induzida pela exposição está associada com uma ativação aumentada de proteínas quinases ativadas por mitógenos23. Além disso, há evidências de que as vias PKCp38ep42/44 MAPK regulam a expressão da Cx4339.
Nosso estudo deve ser analisado considerando uma potencial limitação. Não incluímos um grupo de pré-condicionamento. No entanto, as alterações na Cx43 induzidas pelo pré-condicionamento são bem consolidadas. Portanto, acreditamos fortemente que os nossos dados contribuem com informações importantes acerca do assunto aqui tratado.
O presente estudo demonstrou que a exposição à fumaça do cigarro resultou na remodelação de junções comunicantes cardíaca, caracterizada por alterações na quantidade e fosforilação da Cx43 em corações de ratos. Essa constatação pode explicar o paradoxo dos fumantes observado em alguns estudos.
Concepção e desenho da pesquisa: Novo R, Paiva SAR; Obtenção de dados: Novo R, Freire CM, Felisbino S, Minicucci MF, Azevedo PS;Análise e interpretação dos dados: Novo R, Freire CM, Felisbino S, Minicucci MF, Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR; Análise estatística: Novo R, Minicucci MF, Paiva SAR; Redação do manuscrito: Novo R, Zornoff LAM, Paiva SAR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Freire CM, Felisbino S, Minicucci MF, Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Rosangela Novo pela Faculdade de Medicina de Botucatu.
Leonardo Zornoff Departamento de Clínica Médica, Rubião Jr, S/N CEP 18618-970, Botucatu, SP - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 18/04/12, revisado em 08/10/12; aceito em 18/10/12.
BACKGROUND: In a previous study utilizing the rat model, exposure to tobacco smoke for 5 weeks increased survival after AMI, despite similar age and infarct size between the smokers and nonsmokers, and absence of reperfusion. OBJECTIVE: Thus, this study aimed to analyze the effects of exposure to tobacco smoke on intensity, distribution or phosphorylation of connexin 43 in the rat heart. METHODS: Wistar rats weighing 100 g were randomly allocated into 2 groups: 1) Control (n = 25); 2) Exposed to tobacco smoke (ETS), n = 23. After 5 weeks, left ventricular morphometric analysis, immunohisthochemistry and western blotting for connexin 43 (Cx43) were performed. RESULTS: Collagen volume fraction, cross-sectional areas, and ventricular weight were not statistically different between control and ETS. ETS showed lower stain intensity of Cx43 at intercalated disks (Control: 2.32 ± 0.19; ETS: 1.73 ± 0.18; p = 0.04). The distribution of CX43 at intercalated disks did not differ between the groups (Control: 3.73 ± 0.12; ETS: 3.20 ± 0.17; p = 0.18). ETS rats showed higher levels of dephosphorylated form of Cx43 (Control: 0.45 ± 0.11; ETS: 0.90 ± 0.11; p = 0.03). On the other hand, total Cx43 did not differ between control and ETS groups (Control: 0.75 ± 0.19; ETS: 0.93 ± 0.27; p = 0.58). CONCLUSION: Exposure to tobacco smoke resulted in cardiac gap junction remodeling, characterized by alterations in the quantity and phosphorylation of the Cx43, in rats hearts. This finding could explain the smoker's paradox observed in some studies.
IFaculdade de Medicina de Botucatu
IIInstituto de Biociências de Botucatu, Botucatu, SP - Brasil
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Despite convincing data on the harmful effects of smoking, several studies have reported low mortality after acute myocardial infarction (AMI) for smokers compared with nonsmokers. This phenomenon has been referred as the smoker's paradox 1-4.
Many explanations have been proposed for the more favorable outcomes in smokers after AMI including: 1) smokers are younger and present fewer co-morbidities; 2) they have higher pre-hospital mortality; 3) smokers have a larger thrombus burden, inducing a greater effectiveness of intravenous thrombolysis; 4) ischemic preconditioning-like effect is induced by tobacco smoke. Ischemic preconditioning is a phenomenon whereby a brief period of ischemia renders the myocardium resistant to infarction from a subsequent ischemic insult. Ischemic preconditioning limits infarct size, reduces the incidence of fatal arrhythmias, and protects against stunning myocardium5,6.
In a previous study using the rat model, exposure to tobacco smoke for 5 weeks increased survival after AMI, despite similar age and infarct size between the smokers and nonsmokers, and absence of reperfusion. Importantly, the reduction of mortality was observed within the initial 24 hours after coronary occlusion7. In this model, 87% of early deaths were a consequence of ventricular arrhythmias8. Therefore, we assumed that the smoker's paradox in this model could be a result of a preconditioning-like effect. However, the potential mechanisms of this protection induced by exposure to tobacco smoke are still unknown.
Ischemic preconditioning protection depends on functional channels of gap junction intercellular communication9. The gap junctions in myocardium are specialized intercellular contacts that allow electrical impulse propagation among cardiomyocytes. Connexin 43 (Cx43) is the principal gap junction protein in ventricles of the heart10 and plays a major role in ischemic preconditioning. This fact is evidenced by the finding that ischemic preconditioning cannot induce protection in heterozygous Cx43-deficient mice11. However, the effects of smoking on cardiac Cx-43 remain unknown12. Therefore, to address this issue, we tested the hypothesis that exposure to tobacco smoke would interfere with the intensity, distribution or phosphorylation of Cx43 in the rat heart.
All experiments and procedures were performed in accordance with NIH guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals and were approved by the Animal Ethics Committee of our Institution (protocol number 399).
Male Wistar rats weighing 100 g, were randomly allocated into 2 groups: 1) Control group (n = 25), control rats without exposure to tobacco smoke; 2) Group exposed to tobacco smoke (ETS), n = 23. The tobacco smoke exposure lasted for 5 weeks.
The ETS rats were exposed to cigarette smoke in a chamber (dimensions 95 x 80 x 65 cm) connected to a smoking device based on a model adapted by Paiva et al7,13-17. The smoke was drawn out of filtered commercial cigarettes (composition per unit: 1.1 mg of nicotine; 14 mg of tar; and 15 mg of carbon monoxide) with a vacuum pump and was exhausted into the smoking chamber. During wk 1, the number of cigarettes was gradually increased from 5 to 10 over a 30-min period, twice in the afternoon. For the next approximately 3-4 wk, until the rats reached the target weight, 10 cigarettes were used in each smoking trial, repeated 4 times/d, twice in the morning and twice in the afternoon. In a previous study, with similar tobacco exposure time, the carboxyhemoglobin levels in smoke-exposed rats were greater than in the control group (control rats: 0.9 ± 0.7% and ETS rats: 5.3 ± 2.8%, p= 0.008)14. Thus, the latter study confirmed the efficacy of the exposure of smoking animals to cigarette smoke. All animals were fed the same amount of diet, which was based on the food ingestion of the group ETS. After this period of tobacco smoke exposure, rats were euthanized by an excessive dosage of anesthesia (sodium pentobarbital 100 mg/kg of body weight). Rats in the ETS group were not exposed to tobacco smoke during the 12 h before euthanasia.
At the completion of the treatment period, the right and left ventricles (including the interventricular septum) were dissected, separated, and weighed. Coronal sections, approximately 3 mm in thickness, taken 5 mm from the tip of the ventricles were fixed in a 10% buffered formaldehyde solution for 48 hours followed by immersion in a 70% alcohol solution for 48 hours. After fixation, the tissues were embedded in paraffin. Histological sections four and six microns in thickness were stained, respectively, with Hematoxylin-Eosin (HE) and collagen-specific Picro Sirius red. The myocyte cross-sectional areas (MA) were measured in the HE-stained sections by a LEICA DM LS microscope connected to a video camera and IBM compatible computer, equipped with the image analysis program Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Fifty to seventy cells were analyzed per slide. The selected cells presented a circular shape and were located in the subendocardial layer of the ventricular walls. This precaution was taken in order to optimize myocyte shape uniformity among the groups. The average cross-sectional area obtained for each group was used as an indicator of cell hypertrophy. The slides stained with Picro Sirius red were used to quantify the interstitial collagen volume fraction using video densitometry. Images of the cardiac tissue were taken and analyzed using the system described above. The elements of the cardiac tissue were identified according to color level. Therefore, the collagen fibers were visualized in red and the myocytes in yellow. The collagen volume fraction (CVF) was calculated automatically and corresponded to the sum of the collagen areas divided by the sum of the collagen tissue and myocyte areas. An average of thirty fields was analyzed using a lens with 40X magnification. Perivascular collagen was excluded from the analysis14,16.
Immunohistochemistry experiments were performed according to Saffitz et al18 with some modifications19. All hearts, transversally cut, were fixed, successively, in 10% buffered formaldehyde solution for 24 hours, running water for 24 hours and 70 percent alcohol for 24 hours. After fixation, tissues were embedded in paraffin and sliced into 3-µm sections. Before immunolabeling, tissue characterization and orientation were recorded by hematoxylin-eosin staining.
The sections (3 µm) were placed on poly-D-lysine-coated glass slides and successively dewaxed three times, for 5 minutes each, in baths of xylol, 100% alcohol, 95% alcohol and 70% alcohol followed by rehydration in distilled water for 10 minutes. Antigenic sites were retrieved by treatment of slices in 0.01 M acid citric buffer in phosphate-saline buffer (PBS) pH 6.0 for 10 minutes in microwave environment. After this period, the slices were kept ice-cold for 20 minutes followed by washing in PBS pH 7.2. The sections were blocked with 3% serum albumin bovine (BSA) solution in PBS for 30 minutes at room temperature. After this procedure, the sections were incubated overnight with rabbit polyclonal anti-connexin 43 antibody (Abcam Inc. Cambridge) diluted 1:100 in 2% BSA in PBS at 4 ºC. On the next morning, the sections were washed in PBS for 15 minutes three times and incubated in secondary antibody (Texas-red anti-rabbit IgG, Vector) at 1:50 dilution in 2% BSA in PBS at room temperature for 1 hour.
The sections were washed in PBS for 15 minutes three times and mounted in glycerol medium. Ten sections were processed simultaneously in each immunolabeling run while negative controls, in which the primary antibody was omitted, were routinely run in parallel20 with the objective of monitoring any occurrence of unspecific stain. Immunolabeling of Cx43 was examined by epi-fluorescent microscopy (Carl-Zeiss, Inc. North America) equipped with a WG filter cube (excitation = 550 nm and emission= 650 nm) connected to a video camera and compatible computer (AxioPlan 4.1; Carl-Zeiss Inc.). All images were recorded on the same day as labeling and the tissues were coded and examined blindly by the same person.
From each heart, as described by Kostinet al21, 10 optical fields were recorded and analyzed for distribution of Cx43 in the myocytes (i.e. presence of Cx43 within or outside the intercalated disk) and intensity of Cx43 staining at intercalated disks.
The western blotting experiments were performed according to Rolim et al22. The samples were homogenized in ice-cold lyses buffer (50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0; 0.3 mM sucrose ; 0.5 mM DTT; 1 mM EDTA pH 8.0; 0.3 mM PMSF; 10 mM NaF and protease inhibitor cocktail).
The supernatant was collected by centrifugation at 12000 rpm for 20 minutes and stored at -80 ºC. The determination of proteins was performed by BSA protein standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) curves and the Bradford method. The protein samples were diluted in Laemmli buffer (240 mM Tris-HCl; 0.8% SDS; 40% glycerol; 0.02% bromophenol blue and 200 mM β-mercapthoethanol). Then 50 µg of each sample was separated on 10% polyacrylamide stacking gels (240 mM Tris-HCl pH 6.8; 30% polyacrylamide; APS and TEMED) and resolving gels (240 mM Tris-HCl pH 8.8; 30% polyacrylamide; APS and TEMED). Electrophoresis was run at 120 V for 90 minutes.
The transfer onto nitrocellulose membrane (Bio-Rad) was performed in the Mini-Trans Blot system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) with transfer buffer (25 mM Tris; 192 mM glycine; 20% methanol and 0.1% SDS) for 90 minutes at 120 mA. The blots were blocked with 5% non-fat milk for 2 hours at room temperature with shaking and washing three times in PBS Tween (1mM Tris pH 2.8; 5 mM NaCl and Tween 20). Afterwards, the blots were immunolabeled overnight with a monoclonal mouse anti-Cx43 primary antibody (Ab11369 - Abcam), corresponding to amino acids 130 - 143 of Cx43 diluted to 1: 250 in PBS Tween (1mM Tris pH 2.8; 5 mM NaCl and Tween 20) or monoclonal mouse anti- Cx43 (13-8300 - Zymed) diluted to 3µg/mL, specific to serine 368, an unphosphorylated residue of Cx43.
On the next morning, the membranes were washed three times in PBS Tween (1mM Tris pH 2.8; 5 mM NaCl and Tween 20). This was followed by incubation for 2 hours at room temperature with an HRP- conjugated anti-mouse antibody (Sigma) diluted to 1:10000. After rinsing three times in PBS Tween (1mM Tris pH 2.8; 5 mom NaCl and Tween 20), the membranes were incubated for 1 minute in ECL solution (Amershan) (
After this procedure, densities of the dark bands obtained were analyzed by densitometric quantification of signal intensity by Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA) software with the background measurements of signal intensity being subtracted individually from each Lane19.
Data were expressed as means ± SD. The statistical analysis was performed by Student's
The morphometric variables did not differ statistically between control and ETS groups (
Smoke exposure induced lower stain intensity of Cx43 at ID when compared to control rats (Control: 2.32 ± 0.19; ETS: 1.73 ± 0.18; p
ETS rats showed higher values of dephosphorylated form of Cx43 than control rats (Control: 0.45 ± 0.11; ETS: 0.90 ± 0.11; p
This study aimed to analyze the effects of exposure to tobacco smoke on the intensity, distribution, and phosphorylation of Cx43 in the rat heart. Our data indicated that tobacco smoke exposure induced remodeling of the cardiac gap junctions.
An important issue to be considered is that, in addition to the already well-known effects on the vascular endothelium and lungs, previous studies showed that cigarette smoke exposure that lasts at least two months induces cardiac remodeling, characterized by morphological and functional alterations. Indeed, smoking produced augmentations in the left ventricular diastolic and systolic diameters, and induced left ventricular hypertrophy. These morphological alterations were associated with reduction of left ventricular systolic function7,13,14,16,19,23-27. However, the effects of tobacco smoke exposure on the cardiac gap junctions are still unknown.
The main finding of the present study was thatexposure to tobacco smoke induced remodeling of the cardiac gap junctions. Indeed, the remodeling process was characterized by a lower quantity of Cx43 at ID and an increase in the non phosphorylated form of Cx43 in the myocardium.
Another important issue is that cardiac remodeling characteristically starts with genetic, molecular, cellular, biochemical, and then structural alterations28-31. In this context, our findings of Cx43 alterations and no differences in the left and right ventricular morphological variables can be interpreted as the observation of an early stage of the cardiacremodeling. Therefore, we assume that Cx43 remodeling precedes the morphological and functional alterations induced by tobacco smoke exposure.
Gap junctions are clusters of transmembrane channels that connect the cytoplasmic compartments of neighboring cells. The component proteins of gap junction channels are termed connexins. There are many types of connexins, but the predominant isoform in the heart, mainly in the ventricle, is Cx4310. A major role of gap junctions in the myocardium is to coordinate electrical excitation and to facilitate intercellular change of small proteins, such as signal transduction proteins. Importantly, the normal gap junction functions are related to normal expression and distribution of Cx43, given that Cx43 is located mainly in the intercalated disc of cardiomyocytes. In addition, the degree of Cx43 phosphorylation is critical to gap junction function10.
Alterations in the quantity, localization and phosphorylation of Cx43 have been observed when the heart was submitted to ischemic or hypoxic events21,32,33 and when these events are preceded by ischemic preconditioning34,35. Such ischemia induces reduction of cardiac gap junction, characterized by lower expression of Cx4332,36. Thus, the observed alterations in Cx43 intensity provoked by smoking in the present study are similar to those induced by ischemia.
The diminished Cx43 staining intensityat ID inducedby exposure to tobacco smoke in the present study resembles the effects of ischemic preconditioning, which initiates a process of Cx43 occurrence in the free plasma membrane, outside of the intercalated disks. As a consequence of this effect, ischemic preconditioning may improve the cell's chance of survival following prolonged ischemia35.
With respect to the increase in the non-phosphorylated form of Cx43 induced by exposure to tobacco smoke, many studies have evidenced that the dephosphorylation of Cx43 causes electrical uncoupling in the cardiac myocytes34 and the inhibition of Cx43 dephosphorylation lead to protective effects on cardiac function during hypoxic injury37. In this context, studies found that gap junction-uncoupling agents administered prior to ischemia preserve the electrical coupling of cardiac myocytes during subsequent ischemic insult, similarly to ischemic preconditioning38. These authors suggest that the partial and reversible uncoupling of gap junctions prior to ischemia results in an antiarrhythmic effect during a prolonged ischemic insult, similarly to ischemic preconditioning.
In this context, the present study found that exposure to tobacco smoke produced a remodeling process in the cardiac gap junction, an effect similar to ischemic preconditioning. Therefore, our data strongly suggest that exposure to tobacco smoke may induce an ischemic preconditioning-like effect in the rat heart. Importantly, this phenomenon could explain the smoker's paradox observed in some studies1-4.
The mechanisms involved in the effects of tobacco smoke exposure on cardiac gap junctions are unknown. Among the possible mechanisms, ventricular remodeling induced by such exposure is associated with augmented activation of mitogen-activated protein kinases23. In addition, there is evidence that the PKC p38 and p42/44 MAPK pathways regulate Cx43 expression39.
Our study should be analyzed considering a potential limitation. We did not include a preconditioning group. However, the alterations in the Cx43 induced by the preconditioning are well established. Therefore we strongly believe that our data add important information about this subject.
This study has shown that exposure to tobacco smoke resulted in cardiac gap junction remodeling, characterized by alterations in the quantity and phosphorylation of Cx43, in rats hearts. This finding could explain the smoker's paradox observed in some studies.
Conception and design of the research: Novo R, Paiva SAR; Acquisition of data: Novo R, Freire CM, Felisbino S, Minicucci MF, Azevedo PS; Analysis and interpretation of the data: Novo R, Freire CM, Felisbino S, Minicucci MF, Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR; Statistical analysis: Novo R, Minicucci MF, Paiva SAR; Writing of the manuscript: Novo R, Zornoff LAM, Paiva SAR; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Freire CM, Felisbino S, Minicucci MF, Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Rosangela Novo, from Faculdade de Medicina de Botucatu.