FUNDAMENTO: Vários autores mostraram que a deterioração da função cardíaca associa-se com o grau e a duração da obesidade. Os padrões de expressão gênica após longos períodos de obesidade precisam ser estabelecidos. OBJETIVO: Este estudo testou a hipótese de que a exposição prolongada à obesidade leva à redução nos níveis de RNAm de proteínas envolvidas na homeostase do Ca2+ miocárdico. Além disso, este estudo avaliou se uma diminuição no hormônio tireoidiano causava redução na expressão de RNAm. MÉTODOS: Ratos Wistar machos de 30 dias de idade foram distribuídos em dois grupos: controle (C) e obeso (Ob). O grupo C recebeu uma dieta padrão e o grupo Ob recebeu dietas hiperlipídicas por 15, 30 e 45 semanas. A obesidade foi definida pelo índice de adiposidade. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real quantitativa. RESULTADOS: O índice de adiposidade foi maior no grupo Ob do que no C em todas as etapas. Enquanto a obesidade nas semanas 15 e 45 determinou uma redução no RNAm de Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), trocador Na+/Ca2+ (NCX) e calsequestrina (CSQ), observou-se aumento da expressão do RNAm de canal de Ca2+ do tipo L, receptor de rianodina, SERCA2a, fosfolamban (PLB), NCX e CSQ após a semana 30, em comparação ao grupo C. Não houve associação significativa entre os níveis de T3 e a expressão de RNAm. CONCLUSÕES: Nossos dados indicam que a obesidade por curtos ou longos períodos de tempo pode promover alteração na expressão gênica de proteínas reguladoras da homeostase do Ca2+ sem influência do hormônio tireoidiano
ARTIGO ORIGINAL
BIOLOGIA MOLECULAR
IUniversidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES
IIUniversidade Estadual Paulista, Botucatu, SP
IIIUniversidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil
A obesidade é o distúrbio metabólico crônico mais prevalente nos países desenvolvidos e em desenvolvimento1. Essa doença desempenha papel importante na morbidade cardiovascular através de múltiplos mecanismos, entre os quais a homeostase do cálcio (Ca2+) intracelular2-4. Várias proteínas e canais, como Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), receptor de rianodina (RyR), fosfolamban (PLB), canal de Ca2+ do tipo L, calsequestrina (CSQ) e trocador Na+/Ca2+ (NCX), regulam a homeostase do Ca2+ no músculo cardíaco3,4. Portanto, alterações na expressão e/ou função dessas proteínas reguladoras do Ca2+ poderiam ser responsáveis pela disfunção cardíaca em modelos humanos e experimentais.
Estudos anteriores com avaliações por curtos períodos da expressão gênica das proteínas reguladoras do Ca2+ em modelos de obesidade experimental mostraram resultados díspares5-7. Estudos com cães alimentados com uma dieta hiperlipídica por seis semanas mostraram níveis semelhantes de RNAm do RyR nos grupos controle e de dieta hiperlipídica5. Outros estudos com cães recebendo uma dieta hiperlipídica por nove semanas mostraram redução da expressão gênica do RNAm de SERCA2a e PLB no miocárdio6. Lima-Leopoldo e cols.7 mostraram que ratos obesos recebendo um ciclo de dietas hiperlipídicas por 15 semanas, além de solução de água e açúcar, apresentavam níveis elevados do RNAm de SERCA2a, PLB e RyR. Como muitos autores mostraram que a disfunção cardíaca está associada ao grau e à duração da obesidade, tornou-se necessário estabelecer os padrões de expressão gênica após longos períodos de obesidade.
O coração é um importante órgão-alvo para a ação do hormônio tireoidiano (HT)8-10. Sugeriu-se que a habilidade do HT de regular a função cardíaca envolve seus efeitos genômicos11,12. Nesse aspecto, a influência e/ou o papel do HT nas proteínas reguladoras de Ca2+ tem sido objeto de grande investigação12,13 e vários estudos relataram o envolvimento do HT como modulador da transcrição gênica8,9,14,15. Entretanto, pouco se sabe sobre a relação entre a duração da obesidade, a expressão gênica de proteínas reguladoras do Ca2+ cardíacas e o HT.
Considerando-se essa falta de informação, este estudo teve como propósito testar a hipótese de que a exposição prolongada à obesidade leva à redução dos níveis de expressão do RNAm de proteínas envolvidas na homeostase do Ca2+ miocárdico. Ainda, este estudo verificou se tal diminuição na expressão gênica acompanhou-se de redução nos níveis de HT.
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, São Paulo, Brasil (protocolo 573) e realizados conforme o
Este estudo usou ratos Wistar machos de 30 dias de idade, pesando cerca de 100 g, originários do biotério central da Faculdade de Medicina de Botucatu. Os animais foram alojados individualmente em gaiolas, com livre acesso a água, tendo sido submetidos aos diferentes regimes dietéticos descritos abaixo. Foram mantidos em condições ambientais padrão, com controle de luz (ciclos claro/escuro de 12 h; luz a partir das 6 horas), de temperatura ambiente (23 ± 3ºC), e de umidade relativa (60 ± 5%).
Após sete dias de aclimatação, os ratos foram randomizados em dois grupos: controle (C, n = 30) e obeso (Ob, n = 30). O grupo C recebeu dieta padrão e o grupo Ob recebeu, de forma alternada, quatro dietas hiperlipídicas palatáveis. O ganho de peso e o peso corporal foram monitorados uma vez por semana.
Na semana 3 deste estudo, estabeleceu-se o início da obesidade com base no ganho de peso previamente determinado pelo nosso grupo de estudo (dados não publicados). Nessa ocasião, semana 3, os ratos dos grupos C e Ob foram randomizados em seis novos grupos (C15, Ob15, C30, Ob30, C45 e Ob45), tendo sido mantidas suas respectivas dietas por 15, 30 e 45 semanas consecutivas.
As dietas experimentais foram preparadas sob a forma de pastilhas por Agroceres (Rio Claro, SP, Brasil). A dieta padrão (RC Focus 1765) consistiu em 12,3% kcal de gordura, 57,9% kcal de carboidratos, e 29,8% kcal de proteína. As quatro dietas hiperlipídicas palatáveis (RC Focus 2413, 2414, 2415, e 2416) continham 49,2% kcal de gordura, 28,9% kcal de carboidratos, e 21,9% kcal de proteínas. Essas dietas hiperlipídicas eram hipercalóricas (dieta hiperlipídica = 3,65 kcal/g
Utilizou-se um critério baseado no índice de adiposidade para confirmar a obesidade dos animais. Após serem anestesiados (pentobarbital sódico 50 mg/kg, intraperitoneal), os animais foram decapitados e toracotomizados, e seus coxins adiposos dissecados e pesados. O índice de adiposidade foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: índice de adiposidade = (gordura corporal total (GC)/peso corporal final) × 100. A GC foi determinada a partir da soma dos pesos dos coxins adiposos, como se segue: GC = gordura epididimal + gordura retroperitoneal + gordura visceral.
Os ratos dos modelos de obesidade induzida por dieta podem desenvolver algumas características da obesidade humana, como hipertensão, intolerância à glicose (GL), resistência insulínica, dislipidemia, hiperinsulinemia e hiperleptinemia. As seguintes avaliações foram realizadas em todos os grupos.
Após períodos de observação, a PAS da cauda foi medida em cada animal com o manguito semiautomático para cauda Narco BioSystems® PE 300 (International Biomedical, Austin, TX, EUA). A média de duas medidas foi registrada.
Após 15, 30 e 45 semanas de tratamento, tolerância à GL e resistência insulínica foram avaliadas através de TTG e HOMA-IR, respectivamente. Todos os ratos foram submetidos a jejum de 4-6 horas antes do TTG18. Após o período de jejum, uma amostra de sangue foi colhida da ponta da cauda em um tubo heparinizado. A glicemia basal de cada animal foi imediatamente determinada usando-se um glicosímetro (Accuchek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN, EUA). Em seguida, 2 g/kg de GL (Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, EUA) foram injetados por via intravenosa e a glicemia medida após 15, 30, 60, 90, e 120 minutos18. A intolerância à GL foi avaliada pela área sob a curva (AUC) para GL. O HOMA-IR foi expresso como um índice de resistência insulínica e calculado pela seguinte fórmula: HOMA-IR = [glicemia de jejum (mmol/l) × insulinemia de jejum (µU/ml)]/22,5. Todos os ratos alimentaram-se normalmente e recuperaram seus pesos corporais em até um dia após esse regime.
Ao final de cada período experimental (15, 30 e 45 semanas), os animais foram submetidos a jejum por 12 - 15 h, anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg / kg, intraperitoneal) e decapitados. Amostras de sangue foram colhidas em tubos heparinizados, e o soro separado por centrifugação a 3000 ×
As concentrações séricas de triiodotironina livre (T3) e hormônio tireoestimulante (TSH) foram analisadas usando Diagnostics Products Genese (São Paulo, SP, Brasil) com Luminex Corporation's xMAP TechnologyTM, através de imunoensaio multiplex, Lincoplex kits (Linco Research Inc, St. Louis, MO, EUA).
O RNA total foi extraído do tecido cardíaco (ventrículo esquerdo) utilizando-se Trizol (Invitrogen), de acordo com orientação do fabricante. O
Todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. As características gerais, comorbidades, dosagens hormonais e expressão gênica das proteínas reguladoras do Ca2+ intracelular foram avaliadas através de análise de variância de dois fatores (ANOVA) para amostras independentes. Quando diferenças significativas foram encontradas (p<0,05), aplicou-se o teste de Bonferroni
A
A
O TTG revelou comprometimento da tolerância à GL no grupo Ob em todas as etapas do experimento, o que é consistente com a noção de que obesidade é frequentemente acompanhada de resistência insulínica, que foi observada neste estudo e determinada pelo HOMA-IR. Além disso, a Figura 2D mostra significativa alteração nos níveis séricos de TG na obesidade induzida por dieta hiperlipídica em comparação àqueles nos três grupos C (Ob15>C15 e Ob30>C30; p < 0,05). Na semana 45, os níveis de TG não diferiram significativamente entre os grupos (p = 0,086). A duração da obesidade não teve efeito na PAS nos grupos Ob (
A
Os níveis séricos de T3 e TSH foram determinados para avaliar o papel dos HTs na transcrição gênica induzida por obesidade induzida por dieta hiperlipídica (
Os níveis de RNAm das proteínas reguladoras do Ca2+ intracelular foram analisados para explicar os mecanismos através dos quais a exposição prolongada à obesidade modula a função cardíaca. As medidas do RNAm de SERCA2a, RyR, PLB, canais de Ca2+ do tipo L, CSQ e NCX são apresentadas nas Figuras
O potencial dos HTs para alterar a expressão gênica das proteínas reguladoras do Ca2+ intracelular também foi avaliado. A
A obesidade alcançou níveis epidêmicos recentemente, e seus efeitos adversos foram exaustivamente estudados em animais experimentais. No entanto, há pouca informação disponível quanto à relação entre a duração da obesidade e a regulação do Ca2+. A maior contribuição deste estudo é a demonstração de que a exposição à obesidade altera a expressão gênica das proteínas reguladoras do Ca2+ de maneira diferente. Enquanto a exposição à obesidade por 30 semanas promoveu elevações nos níveis de RNAm, a exposição à obesidade por 15 e 45 semanas resultou em redução dos níveis de RNAm, sugerindo que a obesidade de curta exposição e a de longa exposição possam diferir quanto ao processo de remodelação cardíaca. Além disso, não houve influência dos HTs na expressão gênica das proteínas reguladoras do Ca2+ após longos períodos de exposição à obesidade. Acreditamos que este seja o primeiro estudo a relatar a expressão de RNAm cardíaco de proteínas reguladoras do Ca2+ em animais obesos e o papel dos HTs na regulação da expressão gênica de proteínas reguladoras do Ca2+ em longos períodos de tempo.
Dietas ricas em gordura foram usadas por décadas para os modelos de obesidade em roedores. A dieta hiperlipídica usada teve intensidade e duração suficientes para promover obesidade em ratos em todas as etapas experimentais (15, 30 e 45 semanas). O desenvolvimento de obesidade ao longo do tempo caracterizou-se por diferenças significativas de peso corporal, gordura corporal, coxins adiposos e índice de adiposidade em comparação a ratos controle. Segundo a literatura, o consumo aumentado de gordura pode não se acompanhar de uma elevação na oxidação, o que favorece uma maior deposição de gordura em animais que recebem uma dieta hiperlipídica20. No entanto, neste estudo, o tempo de exposição à dieta hiperlipídica não exacerbou aquela condição, pois a obesidade não foi acompanhada por uma elevação na intensidade ou grau da adiposidade. Como em estudos anteriores21-26, a dieta hiperlipídica usada neste estudo foi eficiente para promover numerosas comorbidades associadas com obesidade de curto e longo prazo, tais como intolerância à GL, hiperinsulinemia, resistência insulínica, hiperleptinemia e dislipidemia, observada pela elevação de TG séricos. Embora não tenha havido alterações significativas nos níveis de TG após 45 semanas (p = 0,086), os níveis de TG tenderam a se elevar com o tempo e com a exposição à obesidade. Tais resultados demonstram que a obesidade prolongada causa alterações nos parâmetros metabólicos e hormonais sem afetar a PAS.
Sabe-se que a obesidade se acompanha de muitas alterações hormonais, como os níveis do HT. Neste estudo, a obesidade causou um aumento nos níveis séricos de TSH após 45 semanas (Ob45 > C45), provavelmente devido aos níveis elevados de leptina no grupo Ob. Estudos com animais experimentais e com seres humanos mostraram que a leptina estimula a liberação de TSH27,28. Além disso, estudos anteriores mostraram uma relação positiva entre níveis séricos de TSH e leptina, indicando que os HTs sofrem um processo de adaptação com a adiposidade crescente29,30. A ausência de alterações nos níveis de leptina e TSH no grupo C ao longo do tempo corrobora essa afirmação. Outro importante achado do presente estudo é que as respostas de T3 e TSH mostraram tendências semelhantes nos grupos Ob ao longo do tempo. Segundo a literatura31, alterações nos níveis de T3 e TSH frequentemente se associam a alterações na gordura corporal, e nossos resultados sugerem que esse efeito possa ser influenciado pelos níveis elevados de leptina ao longo do tempo.
Com relação à pesquisa usando modelos obesos, acreditamos ser este o primeiro estudo a avaliar a influência da exposição prolongada à obesidade na expressão gênica de proteínas reguladoras do Ca2+. Em cardiomiócitos, as proteínas associadas com a regulação do Ca2+ miocárdico participam na liberação, recaptura e extrusão do Ca2+, desempenhando um papel chave na regulação da função cardíaca3,4. O presente estudo mostrou que a duração da obesidade resultou em diferentes respostas na expressão gênica de proteínas reguladoras do Ca2+ após 15, 30 e 45 semanas. Nossos resultados mostraram que a obesidade induzida por uma dieta hiperlipídica causou inicialmente (semana 15) uma redução da expressão gênica. Em consequência, na semana 30, os mecanismos celulares envolvidos no funcionamento do coração aumentaram numa tentativa de reestabelecer os níveis de RNAm cardíaco molecular. Após a normalização desse processo, a transcrição de RNAm voltou a níveis normais e/ou reduzidos (semana 45). Tais achados sugerem que, no presente estudo, houve remodelamento dos processos cardíacos após longos períodos de exposição à obesidade. Rider e cols.32 afirmaram que o remodelamento cardíaco é uma característica adaptativa da obesidade. Segundo Cohn e cols.33, o remodelamento cardíaco é definido como uma expressão genômica que resulta em alterações moleculares, celulares e intersticiais, sendo clinicamente manifesta como alterações de tamanho, forma e função do coração, e resultando de sobrecarga ou lesão cardíaca. Além disso, aqueles autores relatam que o remodelamento cardíaco é influenciado por sobrecarga hemodinâmica, ativação neuro-hormonal e outros fatores ainda em investigação. Logo, uma possível explicação para nossos resultados é que esse processo possa estar relacionado à sobrecarga de gordura imposta ao coração. Após 15 semanas, tal sobrecarga representa uma agressão ao coração (obesidade), que então se remodela para normalizar as alterações cardíacas moleculares e celulares na semana 30. Finalmente, o coração se adapta, retornando aos níveis normais e/ou reduzidos de RNAm (semana 45), uma vez não ser mais necessário manter níveis aumentados de RNA. Esses resultados podem ser corroborados pelos nossos estudos anteriores e outros demonstrando que a obesidade induziu e promoveu disfunção miocárdica17,34,35, que poderia estar relacionada a alterações nos níveis de RNAm após 15 semanas de obesidade. Além disso, pesquisas conduzidas em nosso laboratório mostraram que a função cardíaca volta ao normal após 30 e 45 semanas de obesidade (dados não publicados).
Uma explicação alternativa para a normalização do processo de remodelamento cardíaco após 45 semanas pode estar relacionada à composição da dieta. A dieta hiperlipídica usada neste estudo consistiu de grande quantidade de ácidos graxos insaturados, o que pode ter sido um mecanismo de proteção para o coração, mesmo na presença de obesidade. Os mecanismos subjacentes aos efeitos da exposição prolongada à obesidade nos níveis de RNAm de proteínas reguladoras do Ca2+ permanecem desconhecidos. Os agentes e as vias que podem mediar as respostas moleculares e celulares (alterações na expressão gênica) envolvidas no remodelamento cardíaco incluem várias citocinas, receptores β-adrenérgicos, neurotransmissores, mensageiros intracelulares e hormônios, como a insulina3,36-38.
Um importante mediador envolvido na ativação de vários fatores de transcrição e, portanto, fundamental nas respostas de expressão gênica é o HT. A literatura relata que os HTs podem desempenhar um papel positivo na expressão gênica de SERCA, RyR e canal de Ca2+ do tipo L, e um papel negativo na expressão de PLB e NCX9. Entretanto, em desacordo com essa hipótese, o HT não afetou a expressão gênica de proteínas reguladoras do Ca2+miocárdico, tendo por base a análise de correlação, que demostrou nenhuma associação significativa entre T3 e os níveis de RNAm de proteínas reguladoras do Ca2+. Como mostrado no processo de remodelamento cardíaco, diferentes estímulos externos podem ativar vários fatores de transcrição36. Logo, podemos inferir que o mesmo mediador/estímulo possa ter ativado diferentes fatores de transcrição, levando a respostas semelhantes na expressão gênica. Como a obesidade se associa a níveis elevados de endotelina, angiotensina II e citocinas39,40, que atuam através de diferentes fatores de transcrição, parece provável que alguns desses fatores estejam envolvidos nas mudanças na expressão de RNAm de proteínas reguladoras do Ca2+.
Nossos dados indicam que a obesidade por curtos ou longos períodos de tempo pode promover alteração na expressão gênica de proteínas reguladoras da homeostase do Ca2+ sem influência do HT. Um importante aspecto é que o conhecimento das alterações do RNAm em diferentes etapas durante o desenvolvimento e estabelecimento da obesidade poderia contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvidos na disfunção cardíaca causada pela obesidade. No entanto, estudos adicionais se fazem necessários para determinar quais mediadores influenciam o comportamento do RNAm em cada etapa do processo de remodelamento induzido por obesidade.
Concepção e desenho da pesquisa: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Nascimento AF, Luvizotto RAM, Padovani CR, Nogueira CR, Cicogna AC; Obtenção de dados: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Silva DAT, Nascimento AF, Campos DHS, Luvizotto RAM, Nogueira CR, Oliveira Júnior SA, Cicogna AC; Análise e interpretação dos dados: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Silva DAT, Campos DHS, Luvizotto RAM, Padovani CR, Nogueira CR, Oliveira Júnior SA, Cicogna AC; Análise estatística: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Padovani CR, Cicogna AC; Obtenção de financiamento: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Nascimento AF, Campos DHS, Cicogna AC; Redação do manuscrito: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Nascimento AF, Nogueira CR, Cicogna AC; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Silva DAT, Luvizotto RAM, Padovani CR, Nogueira CR, Oliveira Júnior SA, Cicogna AC.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Ana Paula Lima Leopoldo pela Universidade Estadual Paulista.
Ana Paula Lima-Leopoldo Av. Fernando Ferrari, 514, Goiabeiras CEP 29075-910, Vitória, ES - Brasil E-mail:
Artigo recebido em 10/08/12, revisado em 05/09/12, aceito em 26/10/12.
BACKGROUND: Several authors have shown that deterioration of cardiac function is associated with the degree and duration of obesity. It is necessary to establish the gene expression patterns after prolonged periods of obesity. OBJECTIVE: This study tested the hypothesis that increased duration of exposure to obesity leads to a reduction in the mRNA levels of proteins involved in regulation of myocardial Ca2+ homeostasis. In addition, this study verified whether the decrease in mRNA expression was caused by a reduction in thyroid hormone. METHODS: Thirty-day-old male Wistar rats were distributed in two groups: control (C) and obese (Ob). The C group was fed a standard diet and the Ob was fed with high-fat diets for 15, 30 and 45 weeks. Obesity was defined by adiposity index. The gene expression was assessed by quantitative real-time PCR. RESULTS: The adiposity index was higher in the Ob compared to the C after all periods. While obesity at 15 and 45 weeks resulted in a reduction in mRNA of sarcoplasmic reticulum Ca2+- ATPase (SERCA2a), Na+/Ca2+ exchanger (NCX), and calsequestrin (CSQ), L-type Ca2+ channels, ryanodine receptor, SERCA2a, phospholamban (PLB), NCX, and CSQ expression were increased compared to the C after 30 weeks. There was no significant association between T3 levels and mRNA expression. CONCLUSIONS: Our data indicate that obesity over the short and long periods of time may promote alteration in gene expression of Ca2+ homeostasis regulatory proteins without influence by thyroid hormone.
IUniversidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES
IIUniversidade Estadual Paulista, Botucatu, SP
IIIUniversidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil
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Obesity is the most prevalent chronic metabolic disorder in developed and underdeveloped countries1. This disease plays an important role in cardiovascular morbidity through multiple mechanisms, including intracellular calcium (Ca2+) homeostasis2-4. Several proteins and channels, such as sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a), ryanodine receptor (RyR), phospholamban (PLB), L-type Ca2+ channel, calsequestrin (CSQ) and Na+/Ca2+ exchanger (NCX) regulate Ca2+ homeostasis in cardiac muscle3,4. Thus, alterations in the expression and/or function of these Ca2+ proteins could be responsible for cardiac dysfunction in human and experimental models.
Previous studies with short periods evaluating the gene expression of Ca2+ proteins in experimental obese models have shown disparate results5-7. Studies using dogs which were fed a high fat diet for 6 weeks, showed similar levels of RyR mRNA between control and high-fat diet groups5. Other studies using dogs fed a high-fat diet for 9 weeks, showed decreased mRNA expression of SERCA2a and PLB in the myocardium6. Lima-Leopoldo et al7 showed that obese rats fed a cycle of high-fat diets for 15 weeks, plus a solution of sugar water, had increased mRNA levels of SERCA2a, PLB and RyR. Since several authors have shown that cardiac dysfunction is associated with the degree and duration of obesity, it has become necessary to establish the gene expression patterns after prolonged periods of obesity.
The heart is an important target organ for thyroid hormone (TH) action8-10. The ability of TH to regulate cardiac function has been suggested to involve its genomics effects11,12. In this regard, the influence and/or role of TH on proteins of Ca2+ handling has been an area of intense investigation12,13 and several studies have reported the involvement of TH as modulators of gene transcription8,9,14,15. However, little is known about the relationship between the duration of obesity, gene expression of cardiac Ca2+ proteins and TH.
Considering the lack of information, the purpose of this study was to test the hypothesis that long-term exposure to obesity leads to a reduction in the mRNA expression levels of proteins involved in myocardial Ca2+ homeostasis. Furthermore, this study verified whether the decrease in gene expression was accompanied by a reduction in TH levels.
All procedures involving animals were approved by the Ethics Committee of Botucatu Medical School (UNESP, SP, Brazil) under number (573) and performed in accordance with the
Thirty-day-old male
After 7 days of acclimation, the rats were randomized into two groups: control (C, n = 30) and obese (Ob, n = 30). The C group was fed a standard diet and Ob group were alternately submitted to four palatable high-fat diets. Weight gain and body weight were monitored once a week.
At week 3 of this study, the beginning of obesity based on body weight gain was established, previously determined by our group (
Experimental diets were prepared in pellet form by Agroceres (Rio Claro, SP, Brazil). The standard diet (RC Focus 1765) consisted of 12.3% kcal from fat, 57.9% kcal from carbohydrates, and 29.8% kcal from protein. Four palatable high-fat diets (RC Focus 2413, 2414, 2415, and 2416) contained 49.2% kcal from fat, 28.9% kcal from carbohydrates, and 21.9% kcal from protein. High-fat diets were calorically rich (high-fat diet = 3.65 kcal/g
A criterion based on adiposity index was utilized to confirm animals obesity. After animals had been anesthetized (sodium pentobarbital 50 mg/kg intraperitoneal [i.p.]), decapitated, and thoracotomized, the adipose tissue fat pads were dissected and weighed. The adiposity index was calculated by the following formula: adiposity index = (total body fat (BF)/final body weight) × 100. BF was measured from the sum of the individual fat pad weights as follows: BF = epididymal fat + retroperitoneal fat + visceral fat.
As rat models of diet-induced obesity may develop some characteristics of human obesity, such as hypertension, glucose (GL) intolerance, insulin resistance, dyslipidemia, hyperinsulinemia, and hyperleptinemia, the following evaluations were performed in all groups:
After observation periods, the tail systolic blood pressure (SBP) was assessed in each animal by semi automated tail cuff device Narco BioSystems® PE 300 (International Biomedical, Austin, TX, USA). The average of two pressure readings was recorded.
After 15, 30 and 45 weeks of treatment, GL tolerance and insulin resistance were evaluated by GTT and HOMA-IR, respectively. All rats were fasted for 4-6 h prior to GL tolerance test18. After fasting, a blood sample was collected from the tip of the tail in a heparinized tube. The basal blood GL level of each animal was immediately determined using a handheld glucometer (Accuchek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN). Subsequently, an injection of 2 g/kg GL (Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, USA) was given intravenously and blood GL levels were measured after 15, 30, 60, 90, and 120 min18. GL intolerance was evaluated by the area under the curve (AUC) for GL. The HOMA-IR was expressed as an index of insulin resistance and calculated by the following formula: HOMA-IR=[fasting GL (mmol/l) × fasting insulin(µU/ml)]/22.5. All rats ate normally and regained their body weights within 1 d after this regimen.
At the end of each experimental period (15, 30 and 45weeks), animals were fasted for 12-15 h, anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg i.p.), and euthanized by decapitation. Blood samples were collected in heparinized tubes, and the serum was separated by centrifugation at 3000 ×
The serum concentrations of free triiodothyronine (T3) and thyroid stimulating hormone (TSH) were analyzed using Diagnostics Products Genese (São Paulo, SP, Brazil) with Luminex Corporation's xMAP TechnologyTM, by reaction multiplex immunoassay, Lincoplex kits (Linco Research Inc, St. Louis, MO, USA).
Whole RNA was extracted from cardiac tissue (left ventricle) using Trizol (Invitrogen), according to the manufacturer's instructions. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, USA) was utilized for the synthesis of complementary DNA (cDNA) from 1000 ng of whole RNA. Real-time PCR was used to quantitatively measure the messenger RNA (mRNA) levels of SERCA2a (Rn00568762_m1), RyR (Rn01470303_m1), PLB (Rn01434045_m1), L-type Ca2+ channel (Rn00709287_m1), CSQ (Rn00567508_m1) and NCX (Rn00570527_m1). Quantitative mRNA was measured using TaqMan Universal PCRMaster Mix (Applied Biosystems, CA, USA), according to the manufacturer's instructions, and the Applied Biosystems StepOne Plus detection system. All samples were assayed in triplicate. Cycling conditions were as follows: enzyme activation at 50ºC for 2 min, denaturation at 95ºC for 10min, the cDNA products were amplified for 40 cycles of denaturation at 95ºC for 15 s and annealing/extension at 60ºC for 1 min. Gene expression was quantified in relation to the values of the control groups (C15, C30 and C45, respectively) after normalization by an internal control (β-actin, Rn00667869_m1) and determined by the method 2-ΔΔCt, as previously described19.
All results were reported as mean ± standard deviation. General characteristics, comorbidities, hormonal measurements and gene expression of intracellular Ca2+-cycling proteins were evaluated using two-way analysis of variance (ANOVA) for independent samples. When significant differences were found (p<0.05), Bonferroni's
The general characteristics of rats are shown in
The comorbidities associated with obesity are summarized in
Glucose tolerance test revealed compromised glucose tolerance in the Ob group in all experimental periods, consistent with the notion that obesity is often accompanied by insulin resistance, which was observed in this study determined by HOMA index. Furthermore,
Serum T3 and TSH were determined to evaluate the role of thyroid hormones on gene transcription induced by high-fat diet induced obesity (
Analysis of the mRNA levels for intracellular Ca2+-cycling proteins was performed to understand the mechanism by which long-term exposure to obesity modulates cardiac function. The mRNA measurements of SERCA2a, RyR, PLB, L-type Ca2+ channel, CSQ and NCX are summarized in
The potential role of the thyroid hormones altering gene expression of intracellular Ca2+-cycling proteins was also evaluated.
Obesity is a condition that has reached epidemic levels in recent years, and its adverse effects have been extensively studied in experimental animals. Interestingly, little information is available on the relationship between the duration of obesity and Ca2+ regulation. The major contribution of this current study is that we demonstrated that exposure to obesity alters the gene expression of Ca2+ handling proteins differently. While exposure to obesity for 30 weeks promoted elevations in mRNA levels, in contrast, exposure to obesity for 15 and 45 weeks, resulted in decreased mRNA levels, which suggests a different cardiac remodeling process may occur in short-term
Fat-enriched diets have been used for decades to model obesity in rodents. The high-fat diet used was of sufficient intensity and duration to promote obesity in rats at all experimental time periods, 15, 30 and 45 weeks. The development of obesity over time was characterized by significant differences in body weight, body fat, fat pads and adiposity index in comparison to control rats. According to the literature, increased fat consumption may not be accompanied by an elevation of oxidation, which favors greater deposition of fat in animals fed a high-fat diet20. Nevertheless, in this study, the time of exposure to a high-fat diet did not exacerbate this condition, since obesity was not accompanied by an elevation of the intensity or degree of adiposity. Consistent with previous investigations21-26, the high-fat diet used in this study was effective at promoting numerous comorbidities associated with short and long-term obesity,including glucose intolerance, hyperinsulinemia, insulin resistance, hyperleptinemia, and dyslipidemia observed by elevation in serum TG. Although there were no significant changes in TG levels after 45 weeks (p = 0.086), TG levels showed an increasing trend over time and exposure to obesity. These results demonstrate that obesity over the long periods of time promotes alterations in metabolic and hormonal parameters without effecting on systolic blood pressure.
It is well known that obesity is accompanied by many hormonal changes including thyroid hormone levels. In this study, obesity promoted an increase in serum TSH after 45 weeks (Ob45 > C45), probably caused by high levels of leptin in the obese group. Studies in experimental animals, as well as in human subjects have shown that leptin stimulates TSH release27,28. In addition, previous studies have shown a positive relationship between serum TSH and leptin levels indicating that thyroid hormones undergo a process of adaptation with increasing adiposity29,30. The absence of alterations in leptin and TSH levels in the control group over time corroborates this assertion. Another important finding from our current study is that T3 and TSH response showed similar trends in the obese groups over time. As reported in the literature31, changes in T3 and TSH levels are often associated with alterations in body fat, our results suggest that this effect may be influenced by elevated of leptin levels over time.
Among research using obese models, we believe that this is the first study to verify the influence of long-term exposure to obesity on gene expression of Ca2+ handling proteins. In cardiomyocytes, the proteins associated with myocardial Ca2+ handling participate in the release, recapture and extrusion of Ca2+, executing a key role in the regulation of cardiac function3,4. The current study showed that the duration of obesity resulted in different responses in gene expression of Ca2+ handling proteins after 15, 30 and 45 weeks. Our results showed that obesity, induced by a high-fat caused, initially (15 weeks), decreased gene expression. Consequently, in the 30ª week of induced obesity, the cellular mechanisms involved in functioning of the heart had to increase in an attempt to reestablish molecular cardiac mRNA levels. After normalization of this process, the mRNA transcription returned to normal and/or reduced levels (45 weeks). These findings suggest that, in the current study, there was a remodeling of cardiac processes after long periods of exposure to obesity. Rider et al32 state that cardiac remodeling is an adaptive characteristic of obesity. According to Cohn et al33, cardiac remodeling is defined as genome expression resulting in molecular, cellular and interstitial changes, manifested clinically as changes in size, shape and function of the heart resulting from cardiac load or injury. Furthermore, they point out that cardiac remodeling is influenced by hemodynamic overload, neurohormonal activation and other factors still under investigation. Therefore, a possible explanation for our results is that this process may be related to fat overload imposed to heart, where initially, it suffer one aggression after 15 weeks (obesity), then the heart has to remodel to normalize the cardiac molecular and cellular changes in the week 30. Finally, the heart adapts, returning to normal and/or reduced mRNA levels (45 weeks), since, it was no longer necessary to sustain increased RNA levels. These results may be corroborated with our previous and other studies which demonstrate that obesity induced and promoted myocardial dysfunction17,34,35, where the myocardial dysfunction could be related to changes in mRNA levels after 15 weeks of obesity. Furthermore, researches conducted in our laboratory, shows that cardiac function returns to normal after 30 and 45 weeks of obesity (
An alternative explanation for the cardiac remodeling process to normalize after 45 weeks may be related to diet composition. The high-fat diet used in this study was composed of large amounts of unsaturated fatty acids and this could be a mechanism that protects the heart, even in the presence of obesity. The mechanisms underlying the effects of long-term to exposure to obesity on mRNA levels of Ca2+ handling proteins remain unknown. Several agents and pathways which may mediate the molecular and cellular responses (alterations in gene expression) involved in cardiac remodeling, include various cytokines, β-adrenergic receptors, neurotransmitters, intracellular messengers and hormones such as insulin3,36-38.
One important mediator involved in the activation of several transcriptional factors, and, therefore, fundamental in to gene expression responses is thyroid hormone. The literature reports that thyroid hormones may play a positive role in gene expression of SERCA, RyR and L-type Ca2+ channels, and a negative role in PLB and NCX expression9. However, in disagreement with our hypothesis, thyroid hormone did not affect the gene expression of myocardial Ca2+ handling proteins, based on correlation analysis which showed no significant association between T3 and mRNA levels of Ca2+ handling proteins. As shown in the cardiac remodeling process, different external stimuli can activate several transcriptional factors36. Therefore, we can infer that the same mediator/stimuli may have activated different transcription factors, leading to similar responses in gene expression. Since obesity is associated with increase in endothelin, angiotensin II, cytokines concentrations, among others39,40, and they work via different transcriptional factors, it is likely that some of these factors may be involved in changes in mRNA expression of Ca2+ handling proteins.
Our data indicate that obesity over the short and long periods of time may promote alteration in gene expression of Ca2+ homeostasis regulatory proteins without influence by thyroid hormone. One aspect which is important is that the knowledge of mRNA alterations at different periods during the development and establishment of obesity could contribute to understanding the mechanisms involved in cardiac dysfunction promoted by obesity. Nevertheless, further studies are necessary to determine which mediators influence mRNA behavior at each time period of the remodeling process induced by obesity.
Conception and design of the research: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Nascimento AF, Luvizotto RAM, Padovani CR, Nogueira CR, Cicogna AC; Acquisition of data: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Silva DAT, Nascimento AF, Campos DHS, Luvizotto RAM, Nogueira CR, Oliveira Júnior SA, Cicogna AC; Analysis and interpretation of the data: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Silva DAT, Campos DHS, Luvizotto RAM, Padovani CR, Nogueira CR, Oliveira Júnior SA, Cicogna AC; Statistical analysis: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Padovani CR, Cicogna AC; Obtaining financing: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Nascimento AF, Campos DHS, Cicogna AC; Writing of the manuscript: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Nascimento AF, Nogueira CR, Cicogna AC; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Silva DAT, Luvizotto RAM, Padovani CR, Nogueira CR, Oliveira Júnior SA, Cicogna AC
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP.
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Ana Paula Lima Leopoldo, from Universidade Estadual Paulista.