FUNDAMENTO: o tabagismo apresenta importante papel sobre as doenças cardiovasculares, entretanto permanecem pouco compreendidos os motivos pelos quais alguns seres humanos as desenvolvem e outros não. OBJETIVO: nosso objetivo foi analisar o perfil redox do coração de diferentes linhagens de camundongos após exposição à fumaça de cigarro. MÉTODOS: camundongos machos suíços (n = 10), C3H (n = 10), BALB/c (n = 10) e C57BL/6 (n = 10) foram expostos à fumaça de cigarro (12 cigarros/dia), enquanto os respectivos controles (n = 10) ao ar ambiente por 60 dias. Após sacrifício, o coração foi retirado para análises bioquímicas. RESULTADOS: embora o conteúdo de malondialdeído não tenha aumentado em nenhum grupo, a atividade da catalase diminuiu no grupo suíço (p < 0,05), BALB/c (p < 0,05) quando comparados aos respectivos grupos-controle, enquanto a mieloperoxidase diminuiu no grupo C3H (p < 0,05) e C57BL/6 (p < 0,001) quando comparados aos respectivos grupos controle. O conteúdo de glutationa reduzida diminuiu nos grupos suíço, C3H, C57BL/6 (p < 0,05) e no grupo BALB/c (p < 0,001) quando comparados com os respectivos controles. Observamos aumento do conteúdo da glutationa oxidada no grupo Suíço (p < 0,05) e diminuição nos grupos C3H (p < 0,05) e BALB/c (p < 0,001) quando comparados aos respectivos grupos-controle. A razão glutationa reduzida/ glutationa oxidada apresentou redução nos grupos suíço e C57BL/6 (p < 0.05) quando comparados aos grupos controle. CONCLUSÃO: o background genético nos camundongos pode influenciar na resposta antioxidante após a exposição à fumaça de cigarro e parece ser um fator determinante para o desequilíbrio redox no suíço e C57BL/6. Compreender as respostas antioxidantes e do background genético C3H e BALB/c podem fornecer importantes informações quanto à resistência cardíaca a fumaça de cigarro.
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A fumaça de cigarro, uma mistura composta por mais de 4.700 substâncias1, predispõe a doenças pulmonares2 e cardiovasculares3, como a doença arterial periférica e infarto do miocárdio4. O hábito de fumar aumenta o risco para essas doenças5. A fumaça de cigarro é uma das fontes exógenas de radicais livres como espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERO e ERN, respectivamente). Esses oxidantes desempenham um importante papel na regulação da homeostasia celular, entretanto participam na patogênese de diversas doenças cardiovasculares6. As ERO advindas da exposição à fumaça de cigarro (EFC) possuem a capacidade de iniciar uma cadeia de reações químicas que levam a alterações irreversíveis resultando em disfunção celular e citotoxicidade7. Para impedir a evolução dos danos celulares existe um organizado sistema antioxidante e detoxificador formado por antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e não enzimáticos (glutationa reduzida e oxidada)8. Entretanto, sob condições de excesso de agentes oxidantes e/ou deficiência do sistema protetor, haverá diminuição da atividade da catalase (CAT) e desequilíbrio entre o consumo de glutationa reduzida (GSH) e a produção de glutationa oxidada (GSSG), o que caracteriza o estresse oxidativo9. Em situações em que o sistema de oxirredução está íntegro, haverá recuperação da GSH. A análise indireta do estresse oxidativo feita por meio da atividade de enzimas antioxidantes como CAT, concentração de tripeptídeos como a GSH e GSSG e de peroxidases como mieloperoxidase (MPO) podem fornecer informações importantes sobre o desequilíbrio redox e para terapias futuras.
Estudos sugerem que a EFC nas diferentes linhagens camundongo pode comprometer o processo de cicatrização de feridas da pele10,11. Órgãos de diferentes linhagens de camundongos apresentam respostas ao estresse oxidativo induzido por fumaça de cigarro. Um estudo demonstrou que camundongos C57BL/6 e BALB/c são as melhores escolhas como modelo experimental para investigar as respostas oxidativas da fumaça de cigarro no fígado e pulmão, e as linhagens C3H e C57BL/6 no cérebro12. Entretanto, as respostas oxidativas no coração nas diferentes linhagens de camundongos após a EFC permanecem pouco esclarecidas. Desse modo, esse conhecimento pode favorecer a compreensão dos motivos pelos quais alguns seres humanos desenvolvem doenças cardiovasculares e outros não ao serem tabagistas. Nosso objetivo foi investigar o perfil redox do coração de camundongos Suíços, C3H, BALB/c e C57BL/6 em resposta a EFC.
Foram utilizados camundongos suíços, C3H, BALB/c e C57BL/6 machos (20 animais/linhagem), oito semanas, acondicionados em grupos de dez animais/caixa, com temperatura e umidade controladas (21 ± 2ºC, 50 ± 10%, respectivamente), submetidos aos ciclos invertidos claro/ escuro de 12 h (luzes artificiais, 19 h-7 h) e exaustão 15 min/h no Departamento de Histologia e Embriologia (DHE). Os animais foram separados em um grupo que foi submetido exposição à fumaça de cigarro (grupo EFC - 10 animais/ linhagem) e outro grupo-controle exposto ao ar ambiente (grupo CTR - 10 animais/linhagem) por 60 dias.
Os protocolos de manuseio e experimentação seguiram o
Durante 60 dias por meio da utilização de uma câmara de inalação de fumaça de cigarro, cada grupo EFC foi exposto a 12 cigarros comerciais por dia, três vezes ao dia. Cada cigarro foi acoplado a uma seringa de 60 ml que depois de insuflada a fumaça foi expelida na câmara de inalação. O procedimento de insuflar e desinsuflar terminam com a queima do cigarro até o seu terço final que dura em média três minutos. Cada cigarro gera, aproximadamente, um litro de fumaça que foi diluído em 30 litros presentes na câmara, gerando uma concentração de 3% para inalação durante um total de seis minutos por cigarro. Após esse período, a câmara foi aberta para total exaustão da fumaça, proporcionando aos animais contato com o ar ambiente por um minuto, e, então, o procedimento foi repetido com os cigarros restantes. Durante todo o período de experimento, os animais receberam a ração padrão balanceada e água
Após os 60 dias de EFC ou ao ar ambiente, os animais foram sacrificados por meio de deslocamento cervical e, em seguida, foi realizado uma incisão sagital no tórax do animal para retirada do coração.
O coração foi adicionado ao tubo de hemólise com 1 ml de tampão (KPE), e homogeneizado por meio de um homogeneizador de tecidos (Nova Técnica, SP, Brasil), onde o movimento de trituração foi repetido 10 vezes possibilitando a centrifugação diferencial. Em seguida as amostras homogeneizadas foram centrifugadas a 7.500 rpm por 10 minutos (FANEM®, SP, Brasil), o sobrenadante foi colhido e armazenado a 4 ºC para análise bioquímica e o
O conteúdo da mieloperoxidase (MPO), enzima liberada por neutrófilos, que participa da via antioxidante, por degradar elementos danosos como o peróxido de hidrogênio, foi extraído através da adição de HTBA (hexadecyltrimethylammonium bromide) e TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidine). O tecido foi homogeneizado com 1 ml de HTAB (5 a 50 mg de tecido) ou para as amostras provenientes de fluídos corporais adicionar em tubo com amostra (100 µl) + HTAB (900 µl). Em seguida as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 11.000 RPM (14.000 g), refrigerado a 4 ºC, o sobrenadante foi coletado e as absorvâncias foram determinadas a 650 nm usando um leitor de placa ELISA (modelo 550, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).
Como índice de dano oxidativo, foi utilizada a formação de TBARS durante uma reação de aquecimento ácido como descrito por Draper13. As amostras de homogeneizados de pulmão foram misturados com 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) 10% e 1 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,67% e foram aquecidas em banho-maria por 1 hora. Níveis de TBARS foram determinados por absorbância a 532 nm e expressas como equivalentes de malondialdeído (MDA nM/mg de proteína).
A atividade da CAT (U/mg de proteína) foi mensurada em resposta à quantidade de H2O2 e lida em um comprimento de onda de 240 nm (14). Alíquotas de homogeneizado foram tratadas com ácido sulfossalicílico na proporção de 1:1, a fim de retirar os debris celulares. O sobrenadante foi utilizado nos ensaios de GSH e GSSG. A dosagem de GSH é um método cíclico, pois a GSH reage com o ácido ditionitrobenzóico (DTNB) formando um conjugado (GSH-TNB) e um ânion (TNB). Em seguida, o conjugado reage com o GSH remanescente, formando GSSG e TNB, o qual foi mensurado por espectrofotometria (412 nm). Toda GSSG presente na amostra é convertida à GSH, pela ação da glutationa redutase (GSH-Rd), e o consumo de NADPH. A taxa de produção de TNB é então mensurada, por um método cinético, e é proporcional à concentração inicial de GSH na amostra. A GSSG foi mensurada em amostras tratadas com vinilpiridina, a fim de impedir a conversão cíclica da GSH em GSSG. O método de dosagem de GSSG, também é cinético e se baseia no consumo de NADPH pela glutationa redutase na reação de redução da GSSG à GSH. A GSH reage então com o DTNB gerando o TNB, que foi então mensurado espectrofotometricamente (412 nm)14.
A normalidade de todos os dados foi testada por meio do teste de Kolmogorv-Smirnov. Os dados foram expressos em média ± erro-padrão da média. As análises dos dados foram realizadas pelo teste de variância One-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni, em que foram considerados estatisticamente significativos valores de p < 0.05. O software GraphPad InStat foi usado para análise da performance estatística (GraphPad InStat version 3.00 for Windows 95, GraphPad Software Inc.; San Diego, CA, USA).
Com o objetivo de caracterizar o estresse oxidativo em nosso modelo de EFC, analisamos o dano oxidativo mensurado por meio do TBARS (MDA). Em relação ao conteúdo de MDA nas diferentes linhagens de camundongos EFC, nossos resultados mostraram que não houve aumento do MDA equivalente no grupo EFC das linhagens quando comparados aos grupos CTR (
Em relação à atividade dos antioxidantes nas diferentes linhagens de camundongos EFC, foi observado que atividade da CAT diminuiu nos grupos suíço (p < 0,05), BALB/c (p < 0,05) quando comparados aos respectivos grupos CTR, enquanto a MPO diminuiu no grupo C3H (p < 0,05) e C57BL/6 (p < 0,001) quando comparados aos respectivos grupos CTR (
O conteúdo de GSH diminuiu nos grupos suíço, C3H, C57BL/6 (p < 0,05) e no grupo BALB/c (p < 0,001) após EFC quando comparado com os respectivos CTR (Figura 3A). Após a EFC, foi observado aumento do conteúdo da GSSG no grupo suíço (p < 0,05) e diminuição nos grupos C3H (p < 0,05) e BALB/c (p < 0,001), quando comparado aos respectivos grupos CTR (figura 3B). A razão GSH/GSSG apresentou redução nos grupos suíço e C57BL/6 EFC (p < 0,05) quando comparada aos grupos CTR (Figura 3C).
O remodelamento cardíaco é decorrente das alterações geométricas e volumétricas do coração em resposta à agressão miocárdica15. O estresse oxidativo advém do desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, e o dano oxidativo é causado por esse desequilíbrio que modifica as macromoléculas celulares, levando a morte celular por apoptose ou necrose16. Um estudo experimental mostrou que a exposição crônica ao monóxido de carbono aumentou a expressão gênica de endotelina-1 e induziu hipertrofia cardíaca17. A hipertrofia ventricular foi reconhecida como agente importante no processo de remodelamento, pois estudos anteriores confirmam que a EFC foi seguida pelo aumento no tamanho do ventrículo esquerdo em ratos18. Trinta dias de EFC são suficientes para comprometer a função ventricular19. Entretanto, a EFC por quatro meses provoca a dilatação ventricular associada à redução da função sistólica20.
A sobrecarga pressórica ocasiona estresse oxidativo e a inflamação no sistema cardiovascular3. O dano oxidativo no sistema cardiovascular é analisado por meio da peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e pelo dano ao DNA21. Por mais de trinta anos, as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), como o malondialdeído (MDA), são utilizadas como importante marcador de peroxidação lipídica22. Apesar de camundongos C57BL/6 e BALB/c terem sido descritos como animais propensos a dano oxidativo nos pulmões, após um longo prazo da EFC12, os parâmetros oxidativos seguintes a EFC observados no presente estudo mostraram uma tendência de resistência ao dano oxidativo cardíaco nessas linhagens. Cerca de 80% dos estudos encontram aumento significativo de MDA em fumantes comparado a não fumantes, entretanto tal resultado não é unanimidade21-24. Investigações relacionando a dose-dependência da EFC com o conteúdo de MDA mostraram aumento significativo de acordo com a dose diária de cigarros. Em um estudo, 298 indivíduos saudáveis foram divididos em não fumantes, fumantes (< 30 cigarros/dia) e fumantes (> 30 cigarros/dia), os resultados mostraram uma alta relação entre a EFC e o conteúdo de MDA no plasma (p < 0,0001)25. Em outra investigação com 130 voluntários saudáveis divididos em fumantes leves (
A catalase é uma hemoproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a H2O e O227, sendo localizada em peroxissomos de cardiomiócitos28. Em camundongos transgênicos em que só há catalase isolada dos outros componentes antioxidantes, observou-se que a enzima é constitutiva e expressa em diferentes quantidades no coração e que ao administrar doxorrubicina, o aumento da atividade da catalase aumenta de 60 a 100 vezes protegendo o coração da toxicidade29. A atividade da catalase aumentada provoca resistência à isquemia e reperfusão30. Nossos resultados mostraram que a catalase diminuiu nos grupos EFC das linhagens suíço e BALB/c. Os camundongos BALB/c são resistentes a doenças cardiovasculares induzidas por dieta aterosclerótica, entretanto são sensíveis a doenças imunológicas e inflamatórias31.
A nicotina é capaz de ativar células polimorfonucleares (PMN) com aumento da produção de IL-8 por neutrófilos. Os PMN contribuem significativamente para a iniciação e progressão de inflamação vascular em fumantes, em que a mieloperoxidase (MPO) contribui para o desenvolvimento e progressão de doenças cardiovasculares32. O conteúdo de MPO, uma enzima derivada de neutrófilos que catalisa a formação de numerosas ERO, é significativamente elevado em fumantes em comparação aos não fumantes33. Os macrófagos utilizam NADPH oxidase para produzir O2 - que, ao sofrer dismutação, forma H2O2; logo a MPO catalisa reações com H2O2 para gerar oxidantes citotóxicos mais potentes como ácido hipocloroso (HOCl) e radical tirosil, sendo a única enzima humana capaz de gerar HOCl34. Nossos resultados mostraram uma diminuição da MPO nos grupos EFC das linhagens C3H e C57BL/6. Os camundongos C57BL/6 são suscetíveis às lesões induzidas pela dieta. Quando alimentados com uma dieta aterogênica (1,25% de colesterol, 0,5% de ácido cólico e 15% de gordura) por 14 semanas desenvolvem lesões ateroscleróticas da aorta35.
A MPO está relacionada com ativação da cascata de proteases. A inativação oxidativa de inibidores de proteases como ‘-1-antitripsina e inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) associado à ativação das proelastases e MMPs, afetam o remodelamento cardíaco e a estabilidade de placas ateroscleróticas. Em estudo com ratos nulos para MPO (MPO-/-) com infarto agudo do miocárdio (IAM), os animais apresentaram diminuição do infiltrado leucocitário, a dilatação ventricular e preservação a função sistólica34. Os aldeídos derivados da oxidação de aminoácidos comuns, catalisada pela MPO, representam um mecanismo rápido e relevante para a geração de espécies citotóxicas em sítios inflamatórios33. Um estudo observou um aumento de aldeídos em tecidos pós-infartados de ratos selvagens em relação aos MPO-/-, apontando claramente para o papel da MPO na formação dessas espécies36.
A GSH detoxifica agentes químicos e elimina produtos da peroxidação lipídica37-39. Após exposição da GSH ao agente oxidante, ocorre sua oxidação a GSSG. Na inativação de um agente oxidante ocorre produção de GSSG e depleção de GSH. A recuperação da GSH é feita pela enzima GSH-Rd, uma etapa essencial para manter íntegro o sistema de proteção celular40. Em nossos resultados houve diminuição da GSH em todas as linhagens EFC. Nossos resultados sugerem que GSH-Rd recuperou a GSH nos grupos EFC das linhagens C3H e BALB/c comparados ao CTR, visto que há também diminuição da GSSG nesses grupos. Entretanto, observamos que a GSSG nos grupos EFC do suíço manteve-se aumentada. Em situações em que o sistema de oxirredução está íntegro, haverá recuperação da GSH. Nossos resultados mostraram que a razão GSH e GSSG diminuiu nos grupos EFC das linhagens suíço e C57BL/6, logo as duas linhagens desenvolveram estresse oxidativo.
Os resultados apresentados colocam o estresse oxidativo como ponto a ser considerado nas diferentes populações que apresentam doenças cardiovasculares e abre uma nova discussão sobre a relação entre o perfil genético e o desequilíbrio redox nos modelos experimentais de EFC.
Concepção e desenho da pesquisa: Santos-Silva MA, Nagato AC, Bezerra FS; Obtenção de dados: Santos- Silva MA, Nagato AC, Trajano ETL, Alves JN; Análise e interpretação dos dados: Santos-Silva MA, Nagato AC, Trajano ETL, Alves JN, Bandeira ACB, Bezerra FS; Análise estatística: Bandeira ACB, Porto LC, Bezerra FS; Obtenção de financiamento: Porto LC; Redação do manuscrito: Trajano ETL, Alves JN, Bandeira ACB, Porto LC, Bezerra FS; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Porto LC, Bezerra FS.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Frank Silva Bezerra Laboratório de Bioquímica Metabólica - Departamento de Ciências Biológicas (DECBI) Campus Universitário, s/n - Morro do Cruzeiro CEP 35400-000 - Ouro Preto, MG, Brasil E-mail:
Artigo recebido em 29/02/12, revisado em 14/08/12, aceito em 04/09/12.
BACKGROUND: Smoking plays an important role in cardiovascular diseases. However, the reasons why some individuals develop those diseases and others do not remain to be explained. OBJECTIVE: This study aimed at assessing the redox profile of the heart of different mouse strains after exposure to cigarette smoke. METHODS: Male mice of the Swiss (n = 10), C3H (n = 10), BALB/c (n = 10) and C57BL/6 (n = 10) strains were exposed to cigarette smoke (12 cigarettes/day), while their respective controls (n = 10) were exposed to ambient air for 60 days. After being euthanized, their heart was removed for biochemical analyses. RESULTS: Although the malondialdehyde content did not increase in any of the groups, catalase activity decreased in the Swiss (p < 0.05) and BALB/c (p < 0.05) strain mice as compared with their respective control groups, while myeloperoxidase decreased in the C3H (p < 0.05) and C57BL/6 (p < 0.001) strain mice as compared with their respective control groups. The reduced glutathione content decreased in the Swiss, C3H, C57BL/6 (p < 0.05) and BALB/c (p < 0,001) strain mice as compared with their respective control groups. Regarding reduced glutathione content, an increase was observed in the Swiss strain mice (p < 0.05), while a decrease was observed in the C3H (p < 0.05) and BALB/c (p < 0.001) strain mice as compared with their respective control groups. The reduced glutathione/reduced glutathione ratio showed a reduction in the Swiss and C57BL/6 (p < 0.05) strain mice as compared with their respective control groups. CONCLUSIONS: The genetic background of mice can influence the antioxidant response after exposure to cigarette smoke and seems to be a determinant factor for redox imbalance in Swiss and C57BL/6 strain mice. Understanding antioxidant responses and genetic background of C3H and BALB/c strain mice might provide important information regarding cardiac resistance to cigarette smoke.
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Cigarette smoke, a mixture of more than 4,700 substances1, predisposes to pulmonary2 and cardiovascular3 diseases, such as peripheral artery disease and myocardial infarction4. The smoking habit increases the risk of those diseases5. Cigarette smoke is one of the exogenous sources of free radicals, such as reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS, respectively). Those oxidants play an important role in the regulation of cell homeostasis, and participate in the pathogenesis of several cardiovascular diseases6. The ROSs originating from exposure to cigarette smoke (ECS) have the ability to trigger a chemical reaction chain that leads to irreversible changes, resulting in cell dysfunction and cytotoxicity7. To prevent the progression of cellular damage, there is an organized antioxidant and detoxifying system formed by enzymatic antioxidants (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase) and non-enzymatic antioxidants (reduced and oxidized glutathione, GSH and GSSG, respectively)8. However, in the presence of too much oxidants and/or a deficient protective system, a reduction in catalase (CAT) activity and imbalance between the consumption of GSH and the production of GSSG occur, characterizing oxidative stress9. When the reduction-oxidation (redox) system is intact, GSH recovers. The indirect analysis of oxidative stress performed by measuring the activity of antioxidant enzymes, such as CAT, and the concentration of tripeptides, such as GSH and GSSG, and of peroxidases, such as myeloperoxidase (MPO), can provide important information about redox imbalance and future therapies.
Studies have suggested that exposure of different mouse strains to cigarette smoke can impair cutaneous wound healing10,11. Organs of different mouse strains respond to oxidative stress induced by cigarette smoke. A study has shown that C57BL/6 and BALB/c mice are the best experimental models to investigate oxidative responses to cigarette smoke in the liver and lungs, while C3H and C57BL/6 mice are the best models to study those responses in the brain12. However, the oxidative responses to ECS in the heart of different mouse strains remain to be clarified. Thus, knowing that might explain why some human smokers develop cardiovascular diseases and others do not. This study aimed at investigating the redox profile of the heart of Swiss, C3H, BALB/c and C57BL/6 mice in response to ECS.
Male Swiss, C3H, BALB/c and C57BL/6 mice (20 animals / strain) were stored in groups of ten animals/box at controlled temperature and humidity (21 ± 2ºC, 50% ± 10%, respectively) for eight weeks. They were submitted to inverted 12-hour light/dark cycles (artificial light, 19 h-7 h) and 15 min/h exhaustion cycles at the Department of Histology and Embryology. For each strain, ten animals were exposed to cigarette smoke (ECS groups) and ten animals were exposed to ambient air (control [CTR] groups) for 60 days.
The management and experimentation protocols followed the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (publication 85-23, reviewed in 1985). This project was approved by the Committee of Ethics for laboratory animals (IBRAG - UERJ).
For 60 days, each animal of the ECS groups was exposed to the smoke of 12 commercial cigarettes per day (three exposures per day), in a chamber for cigarette smoke inhalation. Each cigarette was coupled to a 60-mL syringe, which, after being filled with smoke, was emptied into the inhalation chamber. That procedure ended with each cigarette burning up to its final third, taking, on average, three minutes. Each cigarette produced approximately one liter of smoke, which was diluted into the 30 liters present in the chamber, generating a 3% concentration for inhalation during a total of six minutes per cigarette. After that period, the chamber was opened for total exhaustion of the smoke, and the animals had contact with ambient air for one minute. Then, the procedure was repeated with the remaining cigarettes. During the entire experiment, the animals received a standard food preparation and water ad libitum.
After the 60 days of exposure to cigarette smoke or ambient air, the animals were euthanized by cervical dislocation, and had their hearts removed through a sagittal incision in their chests.
The heart was placed inside a hemolysis tube with 1 mL of KPE buffer and was homogenized in a tissue homogenizer (Nova Técnica, SP, Brazil), in which the grinding movement was repeated ten times, enabling differential centrifugation. Then, the homogenized samples were centrifuged at 7,500 rpm for ten minutes (FANEM®, SP, Brazil), the supernate was stored at 4 ºC for biochemical analysis, and the pellet was discarded.
The content of MPO, the enzyme released by neutrophils and that participates in the antioxidant pathway, because it degrades harmful elements, such as hydrogen peroxide, was extracted through the addition of hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) and 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB). The tissue (5 to 50 mg) was homogenized with 1 mL of HTAB, or, when the sample originated from body fluids, 100 µl of it were added to 900 µl HTAB in a tube. Then, the samples were centrifuged for 15 minutes at 11,000 rpm (14,000 g) and refrigerated at 4 ºC. The supernate was collected and absorbance was determined at 650 nm by using an ELISA plate reader (model 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Analysis of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)
The formation of TBARS during an acid-heating reaction as described by Draper was used as an index of oxidative damage13. The samples of homogenized lung were mixed with 1 mL of 10% trichloroacetic acid (TCA) and 1 mL of 0.67% thiobarbituric acid (TBA), and heated for one hour in hot water bath. The TBARS levels were determined by absorbance at 532 nm and expressed as malondialdehyde equivalents (MDA - nM/mg of protein).
Catalase activity (U/mg of protein) was measured in response to the amount of H2O2 and read at the wave length of 240 nm (14)@[esse número é referência?]@. Aliquots of the homogenate were treated with sulfosalicylic acid at the proportion of 1:1 to remove cellular debris. The supernate was used in the GSH and GSSG assays. The GSH measurement is a cyclic method, because GSH reacts with dithionitrobenzoic acid (DTNB), forming a conjugate (GSH-TNB) and an anion (TNB). Then, the conjugate reacts with the remaining GSH, forming GSSG and TNB, which was measured by spectrophotometry (412 nm). All GSSG present in the sample was converted to GSH through the action of glutathione reductase (GSH-Rd) and NADPH consumption. The TNB production rate is then measured by use of a kinetic method, being proportional to the initial GSH concentration in the sample. GSSG was measured in samples treated with vinylpyridine, to prevent the cyclic conversion of GSH to GSSG. The method to measure GSSG is also kinetic and based on NADPH consumption by glutathione reductase in the reduction reaction of GSSG to GSH. Then, GSH reacts with DTNB, generating TNB, which is then measured by use of spectrophotometry (412 nm)14.
The normality of all data was tested by use of the Kolmogorov-Smirnov test. Data were expressed as mean ± standard error of the mean. Data were analyzed by use of the one-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test, in which the significance level adopted was p < 0.05. The GraphPad InStat software was used to assess statistical performance (GraphPad InStat, version 3.00 for Windows 95, GraphPad Software Inc.; San Diego, CA, USA).
Aiming at characterizing oxidative stress in our ECS model, we analyzed the oxidative damage by measuring TBARS (MDA). Regarding the MDA content in the different mouse strains exposed to cigarette smoke, no increase in MDA equivalent was observed in the ECS groups as compared with the CTR groups (
Regarding the activity of antioxidants in the different mouse strains exposed to cigarette smoke, CAT activity decreased in the Swiss (p < 0.05) and BALB/c (p < 0.05) groups as compared with their respective CTR groups, while MPO activity decreased in the C3H (p < 0.05) and C57BL/6 (p < 0.001) groups as compared with their respective CTR groups (
The GSH content decreased in the Swiss, C3H, C57BL/6 (p < 0.05) and BALB/c (p < 0.001) groups after ECS as compared with their respective CTR groups (Figure 3A). After ECS, an increase in the GSSG content was observed in the Swiss group (p < 0.05) and a decrease in the C3H (p < 0.05) and BALB/c (p < 0.001) groups as compared with their respective CTR groups (figure 3B). The GSH/GSSG ratio decreased in the Swiss and C57BL/6 groups (p < 0.05) as compared with their respective CTR groups (Figure 3C).
Cardiac remodeling results from geometric and volumetric cardiac changes in response to myocardial injury15. Oxidative stress originates from the imbalance between oxidants and antioxidants, and the oxidative damage is caused by that imbalance that modifies cellular macromolecules, leading to cell death due to either apoptosis or necrosis16. An experimental study has shown that chronic exposure to carbon monoxide increases the gene expression of endothelin-1 and induces cardiac hypertrophy17. Ventricular hypertrophy has been recognized as an important agent in the remodeling process, as previous studies have confirmed that ECS is followed by left ventricular enlargement in rats18. Thirty days of ECS are sufficient to impair ventricular function19. However, ECS for four months causes ventricular dilation associated with systolic function reduction20.
Pressure overload causes oxidative stress and cardiovascular system inflammation3. The oxidative damage in the cardiovascular system is assessed by use of lipid peroxidation, protein oxidation, and damage to DNA21. For over 30 years, TBARS, such as MDA, have been used as important markers of lipid peroxidation22. Although C57BL/6 and BALB/c mice have been described as animals prone to lung oxidative damage after a long ECS12, oxidative parameters following ECS observed in the present study showed a trend towards resistance to cardiac oxidative damage in those strains. Approximately 80% of the studies have found a significant increase in MDA in smokers as compared with non-smokers; however, that result is not unanimous21-24. Investigations regarding ECS dose-dependency and MDA content have shown a significant increase according to the daily dose of cigarettes. A study with 298 healthy individuals divided into non-smokers, smokers of less than 30 cigarettes/day, and smokers of more than 30 cigarettes/day has shown a strong relation between ECS and MDA plasma content (p < 0.0001)25. Another study with 130 healthy volunteers divided into mild smokers (
Catalase is a cytoplasm hemoprotein that catalyzes the reduction of H2O2 to H2O and O227, being located in the peroxisomes of cardiomyocytes28. In transgenic mice, in which there is only catalase isolated from other antioxidants, the enzyme is constitutive and expressed in different amounts in the heart, and, when doxorubicin is administered, catalase activity increases 60 to 100 times, protecting the heart against toxicity29. Increased catalase activity causes resistance to ischemia and reperfusion30. Our results showed that catalase decreased in the ECS groups of the Swiss and BALB/c strains. BALB/c mice are resistant to cardiovascular diseases induced by an atherosclerotic diet; however, they are sensitive to immune and inflammatory diseases31.
Nicotine can activate polymorphonuclear cells, inducing neutrophils to produce IL-8. Polymorphonuclear cells significantly contribute to the beginning and progression of vascular inflammation in smokers, in which MPO contributes to the development and progression of cardiovascular diseases32. The content of MPO, a neutrophil-derived enzyme that catalyzes the formation of innumerous ROS, is significantly high in smokers as compared with non-smokers33. Macrophages use NADPH oxidase to produce O2-, which, when undergoing dysmutation, forms H2O2; thus, MPO catalyzes reactions with H2O2 to generate more potent cytotoxic oxidants, such as hypochlorous acid (HOCl) and the tyrosyl radical, being the only human enzyme that can generate HOCl34. Our results have shown a decrease in MPO in the ECS groups of the C3H and C57BL/6 strains. C57BL/6 mice are susceptible to diet-induced lesions. When fed an atherogenic diet (1.25% of cholesterol, 0.5% of cholic acid and 15% of fat) for 14 weeks, they develop atherosclerotic lesions in the aorta35.
MPO is related to the activation of the protease cascade. The oxidative inactivation of protease inhibitors, such as α-1-antitripsin and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), in association with the activation of proelastases and matrix metalloproteinases (MMPs) affect cardiac remodeling and the stability of atherosclerotic plaques. In a study of MPO null (MPO-/-) mice with acute myocardial infarction, the animals showed decreased leukocyte infiltration, reduced ventricular dilation, and preservation of the systolic function34. Aldehydes derived from the oxidation of common amino acids, catalyzed by MPO, represent a rapid and relevant mechanism for the generation of cytotoxic species in inflammatory sites33. A study has reported an increase in aldehydes in tissues after infarction in wild rats as compared with MPO-/- mice, clearly indicating the role of MPO in the formation of those species36.
GSH detoxifies chemical agents and eliminates products of lipid peroxidation37-39. After GSH exposure to an oxidant, it is oxidized to GSSG. In the inactivation of an oxidant, GSSG is produced and GSH depleted. GSH is recovered by the GSH-Rd enzyme, an essential step to maintain the integrity of the cell protection system40. We found a reduction in GSH in all strains of the ECS groups. Our results suggest that GSH-Rd recovered GSH in the C3H and BALB/c strains of the ECS groups as compared with the CTR groups, because a reduction in GSSG was also seen in those groups. However, GSSG in the Swiss strains of the ECS groups remained increased. When the redox system is intact, GSH recovers. Our results showed that the GSH/GSSG ratio decreased in the Swiss and C57BL/6 strains of the ECS groups, indicating that both strains developed oxidative stress.
Our results show that oxidative stress should be considered in different populations with cardiovascular disease, and start a new discussion about the relationship between the genetic profile and redox imbalance in experimental models of ECS.
Conception and design of the research: Santos-Silva MA, Nagato AC, Bezerra FS; Acquisition of data: Santos-Silva MA, Nagato AC, Trajano ETL, Alves JN; Analysis and interpretation of the data: Santos-Silva MA, Nagato AC, Trajano ETL, Alves JN, Bandeira ACB, Bezerra FS; Statistical analysis: Bandeira ACB, Porto LC, Bezerra FS; Obtaining financing: Porto LC; Writing of the manuscript: Trajano ETL, Alves JN, Bandeira ACB, Porto LC, Bezerra FS; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Porto LC, Bezerra FS.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
There were no external funding sources for this study.
This study is not associated with any post-graduation program.