FUNDAMENTO: O potencial de renovação e proliferação dos cardiomiócitos, in vivo, é pequeno, e por isso, o músculo cardíaco apresenta limitada capacidade de repor células perdidas. Na tentativa de minimizar os danos oriundos de lesões hipóxico-isquêmicas e daquelas que acometem o sistema de condução do coração, a terapia celular com células-tronco mesenquimais (MSC) vem sendo utilizada, inclusive com cardiomiócitos diferenciados a partir de MSC. OBJETIVO: O presente trabalho comparou três protocolos distintos de indução de diferenciação objetivando a sugestão de um método viável para a diferenciação de maior número de células funcionais que expressem fenótipo cardiomiogênico. MÉTODOS: Culturas de MSC obtidas de tecido adiposo de ratos jovens da linhagem Lewis transgênicos para proteína verde fluorescente (GFP) foram submetidos a três diferentes meios de diferenciação cardiogênica: Planat-Bérnard, 5-azacitidina e meio Planat-Bérnard + 5-azacitidina e observadas quanto a expressão de marcadores celulares cardíacos. RESULTADOS: Nos três protolocos utilizados observou-se formação da proteína alfa-actinina sarcomérica no citoesqueleto das células submetidas à diferenciação, expressão de conexina 43 na membrana nuclear e citoplasmática e formação de gap junctions, necessárias para a propagação do impulso elétrico no miocárdio, contudo, em nenhum protocolo foi observada contração espontânea das células submetidas à diferenciação cardiogênica. CONCLUSÃO: A indução com 5-azacitidina proporcionou diferenciação celular cadiomiogênica efetiva e similar à encontrada com o meio Planat-Bénard e, por ser um protocolo mais simples, rápido e com menor custo torna-se o método de eleição.
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O potencial de renovação e proliferação dos cardiomiócitos,
Na tentativa de minimizar estes danos cardíacos e como alternativa ao transplante de coração, as terapias celulares têm sido propostas como método reparador de áreas de infarto e restaurador do sistema de condução do impulso5. Dentre as células candidatas, as células-tronco mesenquimais (MSC), oriundas de diversas fontes, vem sendo utilizadas devido sua disponibilidade, viabilidade, plasticidade e, recentemente, por serem capazes de expressar fenótipos similares aos cardiomiócitos, em meios específicos de diferenciação6,7.
Valiunas e cols.8 e Kehat e cols.2 demonstraram,
Diferentes protocolos para diferenciação das MSC em cardiomiócitos estão descritos como, por exemplo, estímulos com agentes dimetiladores2,6,10-12,
Com o intuito de propor um método viável, o presente trabalho comparou três protocolos distintos de indução da diferenciação de MSC obtidas do tecido adiposo em cardiomiócitos, visando a produção de células para aplicação em modelos pré-clínicos.
O estudo seguiu os padrões estabelecidos no Guia para Cuidados e Uso de Animais de laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996) e respeitou os Princípios Éticos na Experimentação Animal da Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório (SBCAL). Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), protocolo número 14/2011.
Para a experimentação
Os animais foram submetidos à eutanásia em câmara anestésica, com inalação passiva de isoflurano até a sobredosagem. Foi realizada tricotomia do abdômen e membros pélvicos e em seguida os animais foram transferidos para capela de fluxo horizontal. Foi realizada incisão abdominal na linha branca, exposição do peritônio e remoção da gordura inguinal. O material coletado foi cortado em pequenos pedaços, lavado duas vezes em solução de PBS 0,15M, pH = 7,2, com penicilina, estreptomicina e anfotericina B (PSA - Gibco, Paisley, UK) e armazenado em solução de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB - Gibco) e PSA.
Realizou-se digestão enzimática do tecido adiposo com solução de colagenase do tipo I (Sigma, St Louis MO, USA), por 60 minutos, em estufa a 37ºC, 5% de CO2, agitado a cada 15 minutos. Posteriormente, foi realizada centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos e o precipitado foi ressuspendido em DMEM completo após descarte do sobrenadante. As células foram plaqueadas, inicialmente, na concentração de 5x106 células em frascos de cultura celular de 75 mm2 (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha) e mantidas em estufa à 37ºC com 5% de CO2.
As células foram mantidas em cultura com repiques sucessivos até quarta passagem para serem submetidas à caracterização celular por citometria e/ou até a quinta passagem, quando, então, foram submetidas às etapas de diferenciação.
As células da quarta passagem, derivadas de tecido adiposo, foram caracterizadas por citometria de fluxo através da análise de expressão de moléculas de superfície celular CD 73 (anti-CD73 clone 5 F/B9 mouse - AbCam Cambridge, Massachusetts, EUA), CD 54 (anti-CD54 clone 1A29 mouse - AbCam), CD 90 (anti-CD90 clone Ox-7 mouse - AbCam) e CD 45 (anti-CD45 clone 69 mouse - BD Bioscience, San Jose, Califórnia, EUA), utilizando citômetro de fluxo FACScan e software CellQuest®, obtendo-se 30.000 eventos por amostra testada.
Após a quinta passagem, as células aderentes foram desprendidas com tripsina, contadas e replaqueadas em placa de 6 poços (TPP - Zollstrasse, Trasadingen, Suíça), com lamínulas de 22 mm de diâmetro (Sarstedt), com meio de cultura DMEN enriquecido com 10% de SFB, 10-8mol/mL de dexametasona (Sigma), 5,0 µg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato (Sigma), 10,0 mmol/L de β-glicerofosfato (Sigma) e incubado a 37ºC por quatro semanas. No 30º dia as lamínulas foram lavadas em PBS e coradas pelo método de Von Kossa para observar a deposição de cálcio.
As células na quinta passagem foram desprendidas com tripsina, contadas e replaqueadas na concentração de 1x104 células por lamínula, em meio de cultura DMEN enriquecido com 10% de SFB, em placas de cultivo de seis poços, contendo lamínulas de 22 mm de diâmetro (Sarstedt), e incubadas em estufa.
Após 24 horas do plaqueamento, o meio de cultura foi retirado, os poços lavados com solução de PBS e as placas foram submetidas a protocolos de diferenciação cardiogênica distintos, conforme a
Após o período de indução com os protocolos testados, todas as placas foram lavadas com solução de PBS e as células fixadas com paraformaldeído 4% em tampão fosfato durante 15 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,25% (Roche, Alemanha) em PBS por 10 minutos, seguido de três novas lavagens com PBS. Após o bloqueio com 1% de albumina sérica bovina (BSA) e 5% de soro de cabra diluídos em PBS, as lamínulas contendo as células tratadas foram incubadas individualmente com os anticorpos primários por 2 horas em câmera úmida refrigerada (4ºC).
Os anticorpos utilizados para detecção da diferenciação cardiogênica foram: anticorpo IgG de coelho anti-α-actinina sarcomérica, diluição 1:100 (AbCam) e anticorpo IgG de coelho anti-conexina 43, clone GJA1, diluição 1:400 (CX-43 - AbCam). Os anticorpos secundários utilizados foram: anticorpo de cabra anti-IgG de coelho conjugado ao fluorocromo Alexa 555 (Invitrogen, California, EUA) e anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo conjugado ao fluorocromo Alexa 555 (Invitrogen). O núcleo foi marcado com Hoescht (0,2 µg/mL). As lamínulas foram montadas em lâminas com uma gota de Hydromount (National Diagnostics, USA) e protegidas da luz.
As amostras foram analisadas em microscópio confocal Zeiss 510 Meta e software LSM Image Browser (Carl Zeiss, Stuttgart, Alemanha). Como controles negativos, foram utilizadas as células incubadas apenas com o anticorpo secundário, para cada uma das placas testadas. As imagens foram visualizadas e capturadas separadamente em filtros de 420 a 460 nm (azul), 510 a 560 nm (verde) e 560 a 660 nm (vermelho).
Nos primeiros dois dias de cultura, observou-se que o tecido adiposo propiciou uma cultura heterogênea, composta por células arredondadas, não aderentes e micelas lipídicas no sobrenadante da cultura. A partir do décimo dia, a população celular estava mais homogênea, com predominância das células aderentes de morfologia fibroblastóide, organizadas em colônias.
As trocas do meio de cultura propiciaram a remoção das células não aderentes e das micelas lipídicas e, mediante a visualização de 80% de confluência celular nas placas, as células foram tripsinizadas e uma nova subcultura foi estabelecida.
Durante todo o período de cultivo, as células aderentes mantiveram-se fenotipicamente estáveis sem sinais de senescência.
O ensaio de citometria de fluxo realizado com as células eGFP derivadas de tecido adiposo demonstrou que cerca de 87,2% das células expressaram CD90, 92,1% CD73, 93,2% CD54 e, aproximadamente, 2,17% expressaram CD45 (
As células submetidas à diferenciação osteogênica apresentaram pontos de calcificação da matriz a partir do décimo dia após indução da diferenciação. As células mudaram da aparência fibroblastóide, alongada, para uma forma mais arredondada, assemelhando-se à células da linhagem óssea. A presença da matriz extracelular rica em cálcio, evidenciada pela observação de nódulos de mineralização amarronzados ou negros na coloração de Von Kossa, visualizada no 30º dia, comprovou a diferenciação em osteoblastos das MSC cultivadas. Esses nódulos não foram observados em nenhum período no controle, que também não apresentou modificação morfológica, mantendo a característica fibroblastóide.
As células do G2 submetidas aos protocolos de diferenciação não apresentaram alterações morfológicas em relação ao controle (G1) durante o período avaliado (15 dias), mantendo o formato fibroblastóide e a aderência à placa. Nos grupos G3 e G4 verificou-se aumento do tamanho das células em relação ao controle, de até 20% da área celular e as células fibroblastóides apresentavam-se ligeiramente arredondadas.
Não foram observadas células binucleadas e nem contração espontânea das células submetidas à diferenciação cardiogênica, independentemente do protocolo.
Nos grupos que foi utilizada a 5-azacitidina (G3 e G4), após as primeiras 24 horas das células nos meios de diferenciação, verificou-se 30% de morte celular das células que estavam aderidas. Após esse período, o meio foi trocado conforme descrito no protocolo, as células mortas forma removidas e após cinco dias as células diferenciadas que permaneceram em cultura, expandiram-se em número.
Constatou-se que nos três protocolos testados, as MSC apresentaram expressão de alfa-actinina sarcomérica e conexina 43, modificações que não ocorreram no grupo controle (
As células aderentes observadas na fase inicial do cultivo não representam exclusivamente MSC, pois fibroblastos, macrófagos e algumas células da linhagem hematopoiética podem aderir à placa de cultivo e crescer com características morfológicas semelhantes à MSC16,17, portanto a propriedade de aderência à placa de cultura não é suficiente para considerar a população celular purificada como MSC18, ressaltando a importância do cumprimento das demais etapas de caracterização.
A caracterização fenotípica das MSC do tecido adiposo de ratos Lewis transgênicos para eGFP demonstrou ausência de marcação para CD45 em 98% das células, e expressão de CD73, CD54 e CD90 em 92,1; 93,2 e 87,2% das células, respectivamente. A caracterização fenotípica das células antes da diferenciação celular informa o grau de pureza da cultura, pois outros tipos celulares encontrados na medula óssea e no tecido adiposo podem apresentar características morfológicas similares às MSC
A capacidade de diferenciação osteogênica, exibida pelas células cultivadas do tecido adiposo, reafirma que os tipos celulares cultivados são MSC, pois apenas elas apresentam capacidade de diferenciação osteogênica19,20,24. As MSC mudaram da aparência fibroblastóide para uma forma arredondada, morfologicamente semelhante a osteoblastos22,25,26 e foi observada a formação de nódulos de mineralização, comprovando a diferenciação das células em osteoblastos25-28.
A 5-Azacitidina, o meio de Planat-Bérnard e a associação dos dois, foram capazes de induzir modificações moleculares nas MSC do tecido adiposo de ratos Lewis transgênicos eGFP, gerando células capazes de expressar marcadores cardíacos, semelhantes à cardiomiócitos, similar ao encontrado por Planat-Bérnard e cols.13, Martin-Rendon e cols.15 e Bianco e cols.19.
Os grupos G2, G3 e G4 apresentaram expressão de conexina 43 e alfa-actinina sarcomerica, marcadores moleculares de cardiomiócitos, similar ao observado por outros autores2,6,29,30.
Martin-Rendon e cols.15, demonstraram que a 5-Azacitidina pode ser utilizada na concentração de 5 µM ou 10 µM sem apresentar diferença na indução da diferenciação das MSC em cardiomiócitos. Adicionalmente, diferentes tempos de exposição à 5-Azacitidina (24h, 24h-3 dias-24h, 3 dias, ou 1 semana) não promoveram incremento no número de células diferenciadas15, além de aumentar o efeito genotóxico deste agente dimetilador, recomendando-se utilizar o menor tempo e a menor concentração de 5-Azacitina para induzir a diferenciação, diminuindo também, os custos e o tempo para a obtenção das células desejadas. A concentração de 3 µM de 5-Aza também induziu diferenciação cardiogênica em MSC10,31.
A única alteração morfológica exibida pelas células dos grupos G3 e G4 foi o aumento do tamanho das células, como descrito previamente por Makino e cols.6 que utilizaram a 5-Azacitidina. Estes achados contradizem os achados relatados por Haghani e cols.29 que visualizaram células com morfologia arredondada, maiores que as células fibroblastóides inicialmente presentes na cultura, e células binucleadas. O grupo G2 não apresentou modificações morfológicas evidentes.
Não foi observada contração espontânea em nenhum grupo de tratamento, ao contrário do descrito previamente ao se utilizar a 5-Aza6,15 e o meio de Planat-Bérnard13. Esse resultado corrobora o descrito por Balana e cols.32 que observaram poucas células contráteis,
Embora Planat-Bérnard e cols.13 tenham demonstrado que a exposição à 5-Aza foi necessária para induzir contração, no grupo G3 não foram observadas células com contração espontânea. Contudo, conforme as afirmações de Valiunas e cols.4,8, a ausência de contração espontânea não descarta a possibilidade de utilização destas células na terapia para afecções cardíacas, pois os cardiomiócitos diferenciados a partir das MSC apresentaram modificações moleculares, como a expressão da alfa-actinina sarcomérica e conexina 43, que permitem a contração celular, propagação do impulso elétrico para as outras células do miocárdio e demonstram a existência de
Os dados obtidos,
A indução da diferenciação com a 5-azacitidina é um método mais simples e com menor custo quando comparado ao meio desenvolvido por Planat-Bérnard e cols13. Adicionalmente, os mecanismos de ação da 5-azacitidina são mais conhecidos11,12 e sua utilização na pesquisa é mais difundida6,10,15,34.
Por apresentarem modificações moleculares semelhantes ao cardiomiócito, mas não demonstrar atividade funcional espontânea, admite-se que as MSC foram pré-induzidas à cardiomiócitos, apresentando características celulares para executar as funções de um cardiomiócito11 e, provavelmente, irá acelerar sua ação na terapia de afecções cardíacas em relação à utilização de MSC indiferenciadas. Faz-se necessário a avaliação destas células
Concluiu-se que MSC do tecido adiposo submetidas aos três diferentes protocolos de diferenciação cardiogênica foram pré-induzidas às células diferenciadas que expressaram marcadores de superfície similares à cardiomiócitos e apresentaram estruturas celulares como
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pelo CNPq e FAPEMIG.
Este artigo faz parte da tese de doutorado de Ana Paula Falci Daibert pela Universidade Federal de Viçosa.
Correspondência: Ricardo Junqueira Del Carlo • Av. PH Rolfs, S/N - Departamento de Veterinária - Campus universitário - UFV - 36570-000 - Viçosa, MG, Brasil E-mail:
Recebido em 06/06/12; revisado recebido em 04/08/12; aceito em 15/08/12.
BACKGROUND: Cardiomyocytes have small potential for renovation and proliferation in vivo. Consequently, the heart muscle has limited capacity of self-renewal. Mesenchymal stem cells (MSC) therapy, as well as MSC differentiated into cardiomyocytes, has been used in the attempt to minimize the effects of ischemic-hypoxic lesions and those affecting the electrical conduction system of the heart. OBJECTIVE: The present study compared three distinct protocols for induced differentiation of MSC into cardiomyocytes aimed at finding a viable method for producing a large number of functional cells expressing cardiomyogenic phenotype. METHODS: Mesenchymal stem cells were obtained from the adipose tissue of young transgenic Lewis rats expressing green fluorescent protein (GFP), and submitted to three distinct differentiation-inducing media: 1) Planat-Bérnard, 2) 5-azacytidine, and 3) Planat-Bérnard + 5-azacytidine; further, these cells were identified based on the expression of cardiac cell markers. RESULTS: All three protocols detected the expression of sarcomeric-alpha-actinin protein in the exoskeleton of cells, expression of connexin-43 in the nuclear and cytoplasmic membrane, and formation of gap junctions, which are necessary for electrical impulse propagation in the myocardium. However, no spontaneous cell contraction was observed with any of the tested protocols. CONCLUSION: Induction with 5-azacytidine provided an effective cadiomyogenic cellular differentiation similar to that obtained with Planat-Bénard media. Therefore, 5-azacytidine was the method of choice for being the simplest, fastest and lowest-cost protocol for cell differentiation.
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Cardiomyocytes have small potential for renovation and proliferation
In an attempt to minimize these cardiac damages and as an alternative to heart transplant, cellular therapy has been proposed as a method for repairing infarcted areas and to restore the electrical conduction system5. Due to its availability, feasibility, plasticity, and most recently, its capabilitity for expressing cardiomyocyte phenotypes at specific differentiation media, the MSC originated from a variety of tissues have been utilized6,7.
Valiunas et al8 and Kehat et al2 demonstrated
A variety of protocols regarding MSC differentiation into cardiomyocytes have been described, such as stimulus using demethylating agents2,6,10-12, pool of growth factors13, co-culture with normal cardiomyocytes7, and specific gene insertions4. Despite satisfactory results, the
The present work aimed at identifying a viable method to produce cells for pre-clinical applications. In order to accomplish this, three distinct protocols to induce differentiation of adipose tissue-derived MSC into cardiomyocytes were compared.
Animals were housed in individual cages and maintained at 23°C, 12-h light/dark cycle, fed with commercial chow and tap water
Transgenic rats were obtained by transfecting Lewis rats with lentiviral vectors expressing GFP under the control of ubiquitin C promoter (LEW-Tg eGFP F455/Rrrc). The
To obtain MSC, animals were euthanatized in an anesthetic chamber by passive inhalation of isoflurane until overdose. Prior to placing animals in a laminar flow chamber, hair was clipped from the abdominal area. An incision was made in the Linea Alba to expose the peritoneum and remove the inguinal fat. The material collected was cut in small pieces, treated twice with PBS solution 0.15M, pH = 7.2 containing penicillin, streptomycin, and amphotericin B (PSA - Gibco, Paisley, UK), then maintained in Dulbecco's Modified Eagle Medium solution (DMEM - Gibco)
The adipose tissue was digested with type I collagenase solution (Sigma, St Louis MO, USA) in a 5% CO2 incubator at 37ºC for 60 minutes while shaking every 15 minutes. This mixture was spun at 1500 rpm for 10 minutes, the supernatant removed and the pellet resuspended in complete DMEM. Initially, cells were plated at a concentration of 5x106 in 75 mm2 culture flasks (Sarstedt, Nümbrecht, Germany), and maintained in a 5% CO2 incubator at 37ºC for four to five passages. Prior to the differentiation phase, MSC were characterized by flow cytometry.
Cells were characterized by flow cytometric analysis of the expression of cell surface molecules CD 73 (anti-CD73 clone 5 F/B9 mouse - AbCam Cambridge, Massachusetts, USA), CD 54 (anti-CD54 clone 1A29 mouse - AbCam), CD 90 (anti-CD90 clone Ox-7 mouse - AbCam), and CD 45 (anti-CD45 clone 69 mouse - BD Bioscience, San Jose, Califórnia, USA), using flow cytometry FACScan and CellQuest® software, acquiring 30,000 events/sample, in the fourth passage.
After the fifth passage, adherent cells were detached using trypsine, counted and replated in 6-well plates (TPP - Zollstrasse, Trasadingen, Switzerland). These were covered by 22 mm diameter coverslips (Sarstedt), and maintained with DMEN enriched with FBS 10%, 10-8mol/mL of dexamethasone (Sigma), 5,0 µg/mL of ascorbic acid-2-phosphate (Sigma), and 10,0 mmol/L of β-glycerophosphate (Sigma) media, following incubation at 37ºC for four weeks. On the 300 day, the coverslips were washed with PBS and observed for calcium deposition after Von Kossa staining.
Cells from the fifth passage were detached with trypsine, counted and replated at a concentration of 1x104 cells, maintained with culture media DMEN enriched with FBS 10% in 6-well plates covered by 22 mm diameter coverslips (Sarstedt) in the incubator.
Twenty-four hours later, the culture media was removed, the cells washed with PBS solution, and the plates submitted to distinct protocols of cardiogenic differentiation as depicted in
Plates were incubated in a 5% CO2 incubator at 37ºC for 15 days. During this period, cultures were observed and evaluated regarding morphological alteration and spontaneous contraction of the cells using an inverted optical microscope.
After induction to differentiation, plates were washed with PBS solution and cells fixed with 4% paraformaldehyde in phosphate buffer for 15 minutes. After that, the cells were washed twice with PBS for 10 minutes and permeabilized with 0,25% Triton x-100 (Roche, Germany), followed by three washes with PBS only. The coverslips containing treated cells were blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) and 5% goat serum in PBS. Then, they were incubated with the primary antibody for 2 hours in a humid chamber at 4ºC.
Cardiogenic differentiation was carried out using primary antibodies: rabbit anti-sarcomeric-α-actinin (AbCam), 1:100 dilution, and rabbit anti-connexin 43, clone GJA1(CX-43 - AbCam), 1:400 dilution, followed by goat anti-rabbit and goat anti-rat Alexa 555 fluorochrome conjugated secondary antibodies.
The nucleus was stained with Hoescht (0.2 µg/mL). The coverslips were mounted over the slide with the aid of one drop of Hydromount (National Diagnostics, USA) and protected from light.
Samples were analyzed using confocal microscopy Zeiss 510 Meta and LSM Image Browser software (Carl Zeiss, Stuttgart, Germany). Cells incubated with secondary antibody only were used as negative controls. Images were viewed and individually captured using 420 to 460 nm (blue), 510 to 560 nm (green), and 560 to 660 nm (red) filters.
During the first two days, the culture was heterogeneous containing round and non-adherent cells with lipid micelles in the supernatant. After the 10th day, the cell population became more homogenous presenting an adherent fibroblastoid appearance and formed cell colonies.
Changing the culture media removed non-adherent cells along with lipid micelles. Plates containing 80% of confluent cells required trypsinization to generate new subcultures.
Adherent cells were phenotypically stable demonstrating no signs of senescence throughout the culture period.
Flux cytometry assay from adipose tissue-derived eGFP cells demonstrated that approximately 87.2% of cells expressed CD90, 92.1% CD73, 93.2% CD54, and 2.17% CD45 (
Cells induced to osteogenic differentiation presented calcification in the matrix after the 10th day. These cells changed from fibroblastoid and elongated appearance to rounder shape, similarly to bone marrow lineage. Differentiation of MSC into osteoclasts was certified by the presence of an extracellular matrix rich in calcium, which was evident as brownish and blackish nodules of mineralization stained by Von Kossa staining, on the 30th day. These nodules were not found in the control group; neither did they present any morphological alteration, and maintained fibroblastoid characteristics.
Cells submitted to G2-differentiation protocol did not present morphological alteration compared to the control group (G1), and maintained fibroblastoid nature and its adherence to the plate during the 15-day evaluation period. Groups G3 and G4 presented an area 20% larger than the control group and fibroblastoid cells slightly round.
Regardless of the cardiogenic differentiation protocol, no binucleated cells or spontaneous contraction were observed.
In the 5-azacytidine groups (G3 and G4), 30% mortality of adhered cells was observed 24 hours after being in this differentiation media. Following that, the media was changed as described in the protocol. As this process removed the dead cells, the ones left behind were expanded in number five days later.
The MSC presented sarcomeric-alpha-actinin and connexin 43 expressions in all differentiation groups. However, this was not true for the control group (
The adherent cells observed in the initial phase of the culture did not necessarily represent MSC. Other cells such as fibroblasts, macrophages, and some other hematopoietic cells may adhere to the culture plate and grow with similar morphological characteristics of MSC16,17; therefore, the property to adhere to culture plates is not exclusive of MSC18, hence, this highlights the importance of performing other stages of characterization.
The phenotypic characterization of adipose tissue-derived MSC from Lewis eGFP transgenic rats showed lack of CD45 in 98% of the cells, and expression of CD73, CD54, and CD90 in 92.1; 93.2; and 87.2% of the cells, respectively. The phenotypic characterization of cells prior to differentiation allows inferring the culture's purity level. Other cell types found in bone marrow and adipose tissue may present morphological characteristics similar to MSC
The capability for osteogenic differentiation shown by adipose tissue-derived cells supports that the cells in the study were unquestionably MSC19,20,24. The MSC changed from a fibroblastoid to a rounder appearance resembling osteoblasts22,25,26. In addition, a pattern of mineralization nodules was observed, confirming that these cells, in fact, differentiated into osteoblasts25-28.
The 5-azacytidin, the Planat-Bérnard media, and the association of both were able to induce molecular modifications in adipose tissue-derived MSC from Lewis eGFP transgenic rats, generating cells capable of expressing cardiac markers similar to cardiomyocytes, as found by Planat-Bérnard et al13, Martin-Rendon et al15 and Bianco et al19.
The molecular cardiomyocyte markers connexin 43 and sarcomeric-alpha-actinin protein were expressed in groups G2, G3 and G4, and similar findings were observed by other authors2,6,29,30.
Martin-Rendon et al15 demonstrated that 5-azacytidin can be used at either 5 µM or 10 µM concentration, offering no difference in the induction of MSC to cardiogenic differentiation. Additionally, varying exposure intervals to 5-Aza (24h, 24h-3 days, 3 days, or 1 week) did not promote an increase in the number of differentiated cells15. Conversely, increasing time to 5-azacytidin exposure can further increase the genotoxic effect of this demethylating agent; thus the recommendation is to use the shortest time of exposure and lowest concentration to induce differentiation as this reduces costs and time to acquire the desired cells. The 3 µM of 5-Aza concentration was sufficient to induce cardiogenic differentiation of MSC10,31.
The only morphological alteration exhibited by cells in the G3 and G4 groups was an increase in cell size. This had been previously described by Makino et al6. However, Haghani et al29 observed morphologically round cells, larger than the fibroblastoid cells initially present in the culture, and binucleated cells. Group G2 did not show evidence of morphological alteration.
Spontaneous contraction was not observed in any treatment group, as opposed to previous studies, which used 5-Aza6,15 and Planat-Bérnard media13. This finding corroborates the results obtained by Balana et al32, where only a few contractile cells were observed
Although Planat-Bénard et al13 demonstrated that 5-Aza exposition is required to induce contraction, group G3 presented no cells with spontaneous contraction. However, according to Valiunas et al4,8, the lack of spontaneous contraction does not necessarily rule out the possibility of using these cells for cardiac disease therapy. The reasoning is that those cadiomyocytes differentiated from MSC showed molecular expressions of sarcomeric-alpha-actinin, connexin 43, and gap junctions, which allow cell contraction and electrical impulse propagation to other myocardial cells.
Data obtained
Induction with 5-Aza is a simpler and lower cost method of differentiation compared to the media developed by Planat-Bénard et al13. Additionally, the mechanisms of action of 5-Aza are better known11,12 and its use in research is more widespread6,10,15,34.
For presenting molecular modifications similar to cardiomyocytes, but not showing any spontaneous functional activity, it is admitted that the MSC were pre-induced to cardiomyocytes, and presented cell characteristics to carry out cardiomyocyte functions11, and will possibly accelerate their action in heart disease therapy compared to undifferentiated MSC. However, in order to confirm their functionality in the myocardium, to prove their differentiation into cardiomyocytes and their propagation of physiologic electrical impulses in a synchronized manner, it is necessary to evaluate these cells
Based on these findings, we concluded that adipose tissue-derived MSC subject to three distinct protocols of cardiogenic differentiation were capable of causing pre-induction to differentiated cells. This was documented by expression of gap junctions and sarcomeric-alpha-actinin protein, necessary for electrical impulse propagation and contraction of the heart. Five-Azacytidin is an effective agent in promoting cardiomyogenic differentiation similar to that found using the Planat-Bénard media. Furthermore, 5-Aza is a simpler, faster and lower-cost method of differentiation. Therefore, it is the recommended method to achieve MSC differentiation into cardiomyocytes.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by CNPq and FAPEMIG.
This article is part of the doctoral thesis of Ana Paula Falci Daibert from the Universidade Federal de Viçosa.