FUNDAMENTO: A atividade do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) pode ser modulada pelo colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL-C), estatinas ou polimorfismos, como o T-786C de eNOS. OBJETIVO: Este estudo teve como objetivo avaliar se o polimorfismo T-786C está associado a alterações nos efeitos da atorvastatina no perfil lipídico, nas concentrações de metabólitos de óxido nítrico (NO) e da proteína C reativa de alta sensibilidade (PCR-as). MÉTODOS: Trinta voluntários do sexo masculino, assintomáticos, com idade entre 18-56 anos foram genotipados e classificados de acordo com a ausência (TT, n = 15) ou presença (CC, n = 15) do polimorfismo. Eles foram selecionados aleatoriamente para a utilização de placebo e atorvastatina (10 mg/dia por 14 dias). Após cada tratamento foram medidos lípides, lipoproteínas, frações HDL2 e HDL3, atividade da proteína de transferência de colesteril éster (CETP), metabólitos de NO e PCR-as. RESULTADOS: As comparações entre genótipos após a administração de placebo mostraram aumento da atividade da CETP polimorfismo-dependente (TT, 12 ± 7; CC, 22 ± 12, p < 0,05). As análises da interação entre os tratamentos indicaram que a atorvastatina tem efeito sobre colesterol, LDL, nitrito e razões lípides/proteínas (HDL2 e HDL3) (p < 0,001) em ambos os genótipos. É interessante notar as interações genótipo/droga sobre a CETP (p < 0,07) e a lipoproteína (a) [Lp(a)] (p < 0,056), levando a uma diminuição limítrofe da CETP, embora sem afetar a Lp(a). A PRC-as não mostrou alterações. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que o tratamento com estatinas pode ser relevante para a prevenção primária da aterosclerose em pacientes com o polimorfismo T-786C do eNOS, considerando os efeitos no metabolismo lipídico.
Efeitos da atorvastatina e do polimorfismo T-786C do gene eNOS sobre parâmetros do metabolismo lipídico plasmático
IDepartamento de Patologia Clínica – Laboratório de Lípides, Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental – Faculdade de Ciências Médicas – Universidade Estadual de Campinas; Campinas, SP
IIDepartamento de Farmacologia - Faculdade de Ciências Médicas – Universidade de São Paulo; Ribeirão Preto, SP
IIILaboratório de Lípides (LIM10) – Faculdade de Ciências Médicas – Universidade de São Paulo; São Paulo, SP, Brasil
O endotélio vascular é um sistema complexo, integrado por diversos mediadores químicos. Entre eles, o óxido nítrico se destaca por ser um potente vasodilatador, entre outros efeitos benéficos1,2. Sua síntese depende da atividade do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)3, que, na membrana plasmática e na cavéola, é modulada principalmente pela tensão de cisalhamento laminar e pela presença de agonistas na superfície da célula4.
No entanto, os mecanismos transcricionais e pós-transcricionais também estão envolvidos5,6. Por exemplo, a lipoproteína de alta densidade (HDL) pode mediar a ativação da eNOS através da interação com a apolipoproteína AI e o receptor sequestrante de classe B de tipo I (SR-BI)7, caracterizando, em parte, a atividade de vasodilatação dessa lipoproteína8.
Além disso, a presença de polimorfismos no gene eNOS pode explicar os diferentes níveis de atividade enzimática, que podem ser associados com o aumento do risco cardiovascular9. O promotor do polimorfismo T-786C é o caso mais extensivamente estudado, no qual a presença do alelo C diminui em cerca de 50% a atividade transcricional10, provavelmente o resultado da ligação da proteína repressora RPA1 à região promotora quando esse alelo está presente11. Ao reduzir a atividade enzimática, o alelo C tem sido associado a diminuição da produção de NO9,10, aumento da disfunção endotelial e doenças cardiovasculares12,13.
As estatinas têm efeitos pleiotrópicos conhecidos, que incluem a regulação da função endotelial reduzindo o estresse oxidativo e a trombogenicidade14. Além disso, são responsáveis pela inibição da proteína Rho e a expressão aumentada de eNOS, além da ativação pós-transcricional da via PI3K/AKT15.
Dada a importância tanto da expressão e atividade de eNOS como da presença de partículas de HDL para a função endotelial e a existência de efeitos pleiotrópicos das estatinas sobre essas duas variáveis, este estudo tem por objetivo determinar se a presença do polimorfismo T-786C e o uso de atorvastatina resulta em interações com alterações metabólicas em lípides, metabólitos de NO e PCR-as.
Este estudo foi desenvolvido em parceria entre o Departamento de Farmacologia (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP) e o Departamento de Patologia Clínica (Faculdade de Ciências Médicas – Unicamp), e foi aprovado pelo comitê de ética dessas instituições. Todos os voluntários foram informados sobre a pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e informado.
O número de indivíduos incluídos no estudo foi estimado para permitir um poder estatístico de 80% (β < 0,20; α < 0,05) para detectar diferenças de 30% ou mais entre os dois grupos de genótipos (TT e CC). De acordo com a frequência estimada de genótipos TT (49%) e CC (9%)10,16-18, 200 voluntários do sexo masculino foram selecionados na população local (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil), com idades entre 18-56 anos; eles também eram assintomáticos, caucasianos, não fumantes e não usuários de qualquer medicação. Voluntários do sexo feminino e fumantes foram excluídos.
Esses voluntários foram genotipados para a presença do polimorfismo T-786C do gene eNOS e, para o presente estudo, foram selecionados 15 com o genótipo TT e 15 com o genótipo CC, pareados por idade e pelo índice de massa corporal. Eles se submeteram a um exame clínico minucioso e a testes de laboratório, tendo fornecido um histórico completo de saúde.
O desenho do estudo foi monocego e controlado por placebo. Voluntários com genótipo CC ou TT receberam placebo durante 14 dias, seguido de um tratamento posterior de 14 dias com atorvastatina (Lipitor®, Pfizer, Brasil) na dose de 10 mg/dia, via oral. As amostras de sangue foram colhidas após jejum de 12 horas em tubos contendo EDTA após ambos os tratamentos e foram armazenadas a –70 ºC até a análise.
O DNA genômico foi extraído a partir de 1 mL de sangue total pelo método
Os produtos amplificados foram digeridos com MspI a 37 ºC durante 4 horas, o que produziu fragmentos de 140 e 40 pb para o alelo selvagem (T) ou 90, 50 e 40 pb no caso do alelo polimórfico (C). Os fragmentos foram separados por eletroforese (gel de poliacrilamida a 12%) e visualizados por coloração com prata.
Colesterol, triglicérides, ácidos graxos livres, fosfolípides, colesterol livre no plasma e subfrações de HDL foram quantificados através de métodos enzimático-colorimétricos no sistema automático Boehringer Mannheim-Roche Hitachi 917, usando reagentes comerciais da Roche (Mannheim, Alemanha) e Waco (Chemicals Waco, EUA). As proteínas foram determinadas pelo método do ácido bicinconínico.
Os ésteres de colesterol foram calculados pela fórmula (colesterol total – colesterol livre) × 1,67, e o LDL-C pela fórmula de Friedewald (colesterol LDL = CT – (HDL-C) – TG/2,2), enquanto o HDL-C foi calculado por métodos homogêneos diretos19.
As apolipoproteínas AI e B-100, e a lipoproteína (a), foram determinadas por nefelometria através de reações imunoquímicas em BNII/Marburg, utilizando reagentes de Dade-Behring (Mannheim, Alemanha).
HDL2 e HDL3 foram isoladas utilizando o método de microultracentrifugação20.
LDL-C/apoB-100 e triglicérides/HDL-C foram utilizados para determinar o tamanho estimado de LDL21, enquanto os índices de Castelli I e II foram usados para estimar o risco cardiovascular22.
Para determinar a porcentagem relativa de cada componente (lípides e proteínas) das frações HDL2 e HDL3 relacionada com o HDL total, foi usada a fórmula:
Componente * 100/componente HDL2 + HDL3.
A porcentagem relativa de cada componente, em cada subfração, foi determinada pela fórmula:
Componente HDL/massa total HDL * 100.
A atividade da CETP (%) foi determinada utilizando-se o método radiométrico exógeno23.
Os metabólitos do NO (nitrito/nitrato) foram detectados por ensaio de
A proteína C reativa foi determinada por imunoturbidimetria em um método de elevada sensibilidade (PCR-as), usando o PCR Tina-quant (Latex) HS-Roche.
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar as variáveis entre os dois grupos de genótipos e o uso de atorvastatina e placebo nos mesmos indivíduos. Análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas foi utilizada, seguida pelo teste
Este estudo foi parcialmente financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), São Paulo, Brasil, e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil. Nenhum financiamento externo adicional foi recebido para este estudo.
Os dados basais bioquímicos e antropométricos (média ± DP) obtidos durante o período de seleção nos genótipos TT e CC foram, respectivamente: idade (anos) 27,6 ± 1,8/31,1 ± 2,1, pressão arterial sistólica (mmHg) 123 ± 3/130 ± 2, pressão arterial diastólica (mmHg) 80 ± 3/81 ± 2, índice de massa corporal (kg/m2) 23,9 ± 0,7/25,1 ± 0,7, colesterol total (mg/dL) 161 ± 10/160 ± 10, triglicérides (mg/dL) 103 ± 13/103 ± 2, HDL-C (mg/dL) 36 ± 2/35 ± 2, LDL-C (mg/dL) 104 ± 10/103 ± 9 e VLDL-C (mg/dL) 21 ± 3/21 ± 2.
Os parâmetros bioquímicos foram avaliados nos grupos TT e CC, após a administração de placebo e atorvastatina, e as diferenças são mostradas na
Os efeitos benéficos da atorvastatina sobre os parâmetros do metabolismo lipídico foram independentes do genótipo; o mesmo padrão foi observado em relação aos metabólitos de NO. Os ácidos graxos livres foram menores no grupo CC após a atorvastatina em comparação com o grupo TT (
A atividade da CETP foi significativamente maior no grupo CC após o placebo, mas depois da atorvastatina essa atividade teve um aumento limítrofe no grupo TT e uma redução, embora não significante, no grupo CC.
Foram determinadas as composições químicas de HDL2 após os tratamentos em ambos os genótipos. Não houve diferenças significativas em relação à composição de HDL2 entre TT e CC. No entanto, foram observadas diferenças significativas após a atorvastatina em ambos os genótipos, como o aumento do teor absoluto e relativo das proteínas, a massa total de lipoproteína, o teor absoluto de TAG e a menor proporção relativa da razão CE e lípides/proteínas (
A subfração HDL3 não apresentou diferenças entre os genótipos TT e CC. Após a atorvastatina, tanto o TT como o CC mostraram aumento significativo na CE relativa, massa de proteínas (absoluta) e lípides, enquanto a razão lípides/proteínas e proteínas (relativa) foram menores.
A fim de medir as alterações induzidas pela atorvastatina em ambos os genótipos e as subfrações HDL2 e HDL3, avaliou-se a porcentagem pelo peso de cada componente após a administração de placebo e atorvastatina (
Em relação à composição de HDL2, verificou-se que houve uma redução na porcentagem pelo peso de todos os compostos lipídicos dessa subfração e um aumento significativo de proteínas, independentemente do genótipo. A HDL3 mostrou diminuição dos triglicérides e aumento de proteínas, independentemente do genótipo (
Os resultados significativos e limítrofes obtidos entre os genótipos TT e CC e entre os tratamentos são apresentados na
O polimorfismo T-786C não foi responsável por qualquer alteração nos parâmetros estudados (
O polimorfismo T-786C do gene eNOS é funcionalmente caracterizado por uma redução da atividade promotora do gene, com consequente influência sobre a produção de NO11,25. Estudos recentes demonstraram que os indivíduos homozigóticos para esse polimorfismo têm sensibilidade reduzida à tensão de cisalhamento laminar26, bem como há aumento de marcadores inflamatórios séricos em pacientes com DAC27 estabelecida, aumento do risco de mortalidade e o desenvolvimento de disfunção renal quando submetidos a cirurgia cardíaca de emergência28.
Embora o efeito das estatinas sobre o genótipo CC tenha sido previamente avaliado, especialmente o efeito anti-inflamatório da atorvastatina25, ainda existem alguns pontos inexplorados, como o impacto da interação entre o polimorfismo e o medicamento no metabolismo lipídico e subfrações de HDL.
O nosso estudo demonstrou que a atorvastatina teve um efeito principalmente genótipo-independente, dadas as reduções nos lípides, razões lípides/proteína (HDL2 e HDL3), índice de Castelli I, ácidos graxos livres e maior tamanho estimado de LDL; esse efeito de redução de lípides está de acordo com estudos anteriores29,30.
Os genótipos TT e CC não foram diferentes em relação à composição química de HDL2 e HDL3; todas as alterações na composição foram determinadas pela atorvastatina. Na HDL2, observamos diminuição em todos os lípides, com aumento significativo nas proteínas. Essa descoberta sugere que a HDL2 tornou-se mais deslipidada, sem qualquer alteração no número de partículas. Além disso, houve enriquecimento de lipídios e proteínas na HDL3 – com a consequente diminuição da razão lipídio/proteína, o que aponta para um aumento do número de partículas da HDL3.
Esse conjunto de alterações sugere um aumento da atividade da lipase hepática, em contraste com estudos que mostram que a atorvastatina seria responsável pela diminuição de sua atividade31. Por outro lado, o aumento das partículas de HDL3 sugere que a atorvastatina promoveu a troca entre os lipídios neutros e as lipoproteínas e tornou as HDL2 enriquecidas em triglicérides, um substrato ideal para a formação de partículas de HDL332,33.
No nosso estudo, não foram observadas interações entre PCR-as e a atorvastatina, apesar da redução de 40% após o tratamento. Gensini e cols.34 demonstraram que o tratamento com atorvastatina, particularmente na dose de 80 mg/dia, reduz eficazmente os níveis plasmáticos de PCR-as, apesar da presença de síndrome metabólica ou diabetes melito.
Observamos que os metabólitos de NO diminuíram significativamente após o tratamento com atorvastatina; os mesmos resultados foram observados em pacientes com doença arterial periférica35. No entanto, a maioria dos estudos aponta para um aumento ou manutenção dos seus níveis36.
Foram observadas interações limítrofes entre atorvastatina e genótipo CC para CETP e Lp(a). A Lp(a), embora não tenha sido diferente entre os grupos, apresentou a tendência de aumentar no grupo CC após a atorvastatina. Além disso, estudos anteriores mostraram que a presença do polimorfismo T-786C em pacientes diabéticos é um fator de risco independente na redução da vasodilatação endotélio-dependente37.
É interessante notar que os voluntários CC mostravam uma atividade da CETP significativamente maior, que diminuiu, embora não significativamente, após o uso de estatina. Por outro lado, depois das estatinas, o grupo TT mostrou um aumento limítrofe. O aumento da atividade da CETP reduz a HDL e aumenta seu catabolismo pela lipase hepática38. Assim, o uso de atorvastatina "corrigiu" a condição inicial da CETP no grupo CC, uma vez que a atorvastatina foi capaz de reduzir a sua atividade15,31. Um estudo realizado na população chinesa mostrou que a presença de T-786C e Taq1B (um polimorfismo do gene CETP) é responsável pela maior predisposição à fibrilação atrial não valvular39, contribuindo para a possibilidade de existência de relações mais complexas entre essas duas variáveis, além do aumento da atividade de CETP.
No genótipo CC, foi demonstrada uma redução significativa de ácidos graxos livres após a utilização de atorvastatina, mas não houve nenhuma alteração no genótipo TT. Isso sugere que o polimorfismo pode ter efeito benéfico através de uma mobilização menor de ácidos graxos livres do tecido adiposo para o plasma e o fígado, facilitando o efeito supressor de estatinas nos ácidos graxos livres do plasma. Os mecanismos envolvidos não estão totalmente elucidados40.
Gostaríamos de comentar alguns pontos do estudo que poderiam ser considerados para estudos futuros, como o fato de que não foram avaliados os efeitos de outras doses de atorvastatina e/ou outras estatinas. Além disso, o estudo foi realizado somente em homens caucasianos saudáveis e em número relativamente pequeno de indivíduos, fato que pode ter limitado a capacidade para detectar diferenças entre os grupos estudados.
Estes resultados em conjunto indicam que o tratamento com estatinas pode ser relevante para a prevenção primária da aterosclerose em pacientes com o polimorfismo T-786C do gene eNOS, considerando os efeitos sobre o metabolismo lipídico.
Gostaríamos de agradecer à Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro para este trabalho.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP e CNPq.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Vanessa Helena de Souza Zago pela Faculdade de Ciências Médicas – Universidade Estadual de Campinas.
Eliana Cotta de Faria Rua Tessália Vieira Camargo, 126 - Cidade Universitária 13083-887 – Campinas, SP, Brasil E-mail:
Artigo recebido em 22/05/12
revisado recebido em 17/09/12
aceito em 26/09/12.
BACKGROUND: Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity may be modulated by high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), statins or polymorphisms, such as the T-786C of eNOS. OBJECTIVE: This study aimed at evaluating if the T-786C polymorphism is associated with changes of atorvastatin effects on the lipid profile, on the concentrations of metabolites of nitric oxide (NO) and of high sensitivity C-reactive protein (hsCRP). METHODS: Thirty male volunteers, asymptomatic, aged between 18 and 56 years were genotyped and classified according to absence (TT, n = 15) or presence (CC, n = 15) of the polymorphism. They were randomly selected for the use of placebo or atorvastatin (10 mg/day/14 days). After each treatment lipids, lipoproteins, HDL2 and HDL3 composition, cholesteryl ester transfer protein (CETP) activity, metabolites of NO and hsCRP were evaluated. RESULTS: The comparisons between genotypes after placebo showed an increase in CETP activity in a polymorphism-dependent way (TT, 12±7; CC, 22±12; p < 0.05). The interaction analyses between treatments indicated that atorvastatin has an effect on cholesterol, LDL, nitrite and lipid-protein ratios (HDL2 and HDL3) (p < 0.001) in both genotypes. Interestingly, we observed genotype/drug interactions on CETP (p < 0.07) and lipoprotein (a) (Lp(a)) (p < 0.056), leading to a borderline decrease in CETP, but with no effect on Lp(a). HsCRP showed no alteration. CONCLUSION: These results suggest that statin treatment may be relevant for primary prevention of atherosclerosis in patients with the T-786C polymorphism of eNOS, considering the effects on lipid metabolism.
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The vascular endothelium is a complex system, integrated by several chemical mediators. Among them, nitric oxide stands out by being a potent vasodilator, amongst other beneficial effects1,2. Its synthesis depends on the activity of endothelial nitric oxide synthase (eNOS)3, which, in the plasma membrane and caveolae, is modulated mainly by laminar shear stress and the presence of agonists on the cell surface4.
However, transcriptional and post-transcriptional mechanisms are also involved5,6. For example, high density lipoprotein (HDL) can mediate the activation of eNOS through interaction with apolipoprotein AI and scavenger receptor class B type I (SR-BI)7, characterizing in part the vasodilation activity of this lipoprotein8.
Moreover, the presence of polymorphisms in the eNOS gene may explain different levels of enzyme activity, which may be associated with increased cardiovascular risk9. The promoter of polymorphism T-786C is the most extensively studied case, where the presence of the C allele reduces transcriptional activity by approximately 50%10, probably the result of the binding of the repressor protein RPA1 to the promoter region when this allele is present11. By reducing the enzymatic activity, the C allele has been associated with an impaired NO production9,10, increased endothelial dysfunction and cardiovascular diseases12,13.
Statins have known pleiotropic effects, which include the regulation of endothelial function reducing the oxidative stress and thrombogenicity14. Moreover, they are responsible for the inhibition of Rho protein and increased eNOS expression, plus the post-transcriptional activation of PI3K/AKT pathway15.
Given the importance of both expression and activity of eNOS, as well the presence of HDL particles for endothelial function, and the pleiotropic effects of statins on these two variables, this study aims to determine whether the presence of T-786C polymorphism and the use atorvastatin results in interactions with metabolic alterations in lipids, metabolites of NO and hsCRP.
This study was developed in partnership between the Department of Pharmacology (Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto – USP) and the Department of Clinical Pathology (Faculdade de Ciências Médicas– UNICAMP), and was approved by the Ethics Committee of those institutions. All volunteers were informed of the research terms and signed the written free and informed consent form.
The number of subjects enrolled in this study was estimated to allow a statistical power of 80% (β <0.20; α <0.05) to detect differences of 30% or more between the two groups of genotypes (TT and CC). According to the estimated frequency of TT (49%) and CC (9%) genotypes10,16-18, 200 male volunteers were selected from the local population (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil), aged between 18 and 56 years; they also were asymptomatic, Caucasian, nonsmokers, and did not use any medication. Female volunteers and smokers were excluded.
These volunteers were genotyped for presence of T-786C polymorphism of the eNOS gene, and for the present study, 15 individuals with the TT genotype and 15 with the CC genotype, were selected and matched by age and body mass index. They underwent thorough clinical examination and laboratory tests, and provided a complete health history.
The study had a placebo-controlled, single-blind design. Volunteers with CC or TT genotype received a placebo for 14 days, followed by further treatment for 14 days with atorvastatin (Lipitor® Pfizer, Brazil) 10 mg/day orally. Blood samples were drawn after 12-hour fasting and collected in tubes containing EDTA after both treatments and the samples were stored at -70 ºC until analysis.
Genomic DNA was extracted from 1 mL of whole blood by salting-out method and stored at -20 ºC until analysis. The genetic variants of the T-786C polymorphism located in the 5 'region of the eNOS gene were determined by amplification by polymerase chain reaction, as previously described16.
The amplified products were digested with MspI at 37 ºC for four hours, which produced fragments of 140 and 40 bp for the wild allele (T) or 90, 50 and 40 bp in the case of the polymorphic allele (C). The fragments were separated by electrophoresis (12% polyacrylamide gel) and visualized by silver staining.
Cholesterol, triglycerides, free fatty acids, phospholipids and free cholesterol from plasma and HDL subfractions were quantified using enzymatic-colorimetric methods in the automated Boehringer Mannheim-Roche Hitachi 917 system, using commercial reagents from Roche (Mannheim, Germany) and Waco (Waco Chemicals, USA). The proteins were determined by bicinchoninic acid assay (BCA) method.
Cholesterol esters were calculated by the formula: (total cholesterol – free cholesterol) x 1.67, and LDL-C by Friedewald formula (LDL cholesterol = TC – (HDL-C) – TG/2.2), whereas HDL-C was calculated by homogeneous direct methods19.
Apolipoproteins AI, B-100 and lipoprotein (a) were determined by nephelometry through immunochemical reactions in BNII/Marburg, using Dade-Behring reagents (Mannheim, Germany).
HDL2 and HDL3 were isolated using the micro-ultracentrifugation method20.
LDL-C/apoB-100 and triglycerides/HDL-C were used to determine the estimated size of LDL21, while the Castelli indexes I and II were used to estimate cardiovascular risk22.
To determine the relative % of each component (lipids and proteins) of HDL2 and HDL3 related to the total HDL, the formula:
component*100/component HDL2+HDL3 was used.
The relative % of each component, in each subfraction, was determined by the formula:
HDL component/total mass HDL*100.
CETP activity (%) was determined using the exogenous radiometric method23.
NO metabolites (nitrite/nitrate) were detected by the commercial assay Nitric Oxide (NO2-/NO3-) Assay Kit (StressGen, Assay Designs, Inc.). The variable NOx was calculated as the sum of the concentrations (µmole/L) of nitrite and nitrate, and the nitrite/nitrate ratio by the relationship between the two analytes. The reference values for NOx range between 11.5 and 76.4 µmole/L24.
C-reactive protein was determined by immunoturbidimetry in a high sensitivity method (hsCRP), using the Tina-quant CRP (Latex) HS-Roche.
The Mann-Whitney test was used to compare the variables between the two genotype groups and the use of atorvastatin and placebo in the same subjects. ANOVA for repeated measures followed by Tukey's post-hoc, profile test by contrasts or the BOX-COX test was used for multiple comparisons and to detect interactions. The level of significance for statistical tests was 5% or p
This study was partially supported by the Foundation for Research Support of the State of São Paulo (FAPESP), SP, Brazil and by the National Council for Scientific and Technological Development, Brazil. No additional external funding was received for this study.
Baseline biochemical and anthropometric data (average ± SD) obtained during the selection period, in the TT and CC genotypes were, respectively: age (years) 27.6±1.8/31.1±2.1, systolic blood pressure (mmHg) 123±3/130±2, diastolic blood pressure (mmHg) 80±3/81±2, body mass index (kg/m2) 23.9±0.7/25.1±0.7, total cholesterol (mg/dL) 161±10/160±10, triglycerides (mg/dL) 103±13/103±2, HDL-C (mg/dL) 36±2/35±2, LDL-C (mg/dL) 104±10/103±9 and VLDL-C (mg/dL) 21±3/21±2".
The biochemical parameters were evaluated in groups TT and CC after administration of placebo and atorvastatin and the differences are shown in
The beneficial effects of atorvastatin on lipid metabolism parameters were independent from the genotype; this same pattern was observed regarding NO metabolites. Free fatty acids were lower in the CC group after atorvastatin, when compared with TT (
CETP activity was significantly higher in CC group after placebo, but after atorvastatin this activity showed a borderline increase in TT and a decrease, albeit not significant, in CC.
The chemical compositions of HDL2 after the treatments in both genotypes were also determined. No significant differences were seen regarding HDL2 composition between TT and CC. However, significant differences were observed after atorvastatin in both genotypes, such as the increase in absolute and relative content of proteins, total lipoprotein mass , absolute content of TAG; and lowest relative CE and lipids/proteins ratio (
HDL3 subfraction showed no differences between TT and CC genotypes. After atorvastatin, both TT and CC showed a significant increase in relative CE, proteins (absolute) and lipids mass, while lipids/proteins ratio and proteins (relative) were lower.
In order to measure changes induced by atorvastatin in both genotypes and the HDL2 and HDL3 subfractions, we assessed the percentage by weight of each component after administration of placebo and atorvastatin (
Regarding the composition of HDL2, it was observed that there was a reduction in the percentage by weight of all lipid compounds of this subfraction, and a significant increase of proteins, regardless of genotype. HDL3 showed a decrease in triglycerides and an increase in proteins, regardless of the genotype (
The significant and borderline results obtained between the TT and CC genotypes and between treatments are shown in
The T-786C polymorphism was not responsible for any changes in the studied parameters (
The T-786C polymorphism of eNOS gene is functionally characterized by a reduction of the gene promoter activity, with consequent influence on NO production11,25. Recent studies have demonstrated that individuals homozygous for this polymorphism have a reduced sensitivity to laminar shear stress26 as well as an increase in serum inflammatory markers in patients with established CAD27 and increased risk of mortality and development of renal dysfunction when undergoing emergency heart surgery28.
Although the effect of statins on the CC genotype has been previously assessed, especially the anti-inflammatory effect of atorvastatin25, there are still some unexplored points, such as the impact of the interaction between the polymorphism and the drug on lipids metabolism and HDL subfractions.
Our study demonstrated that atorvastatin had an effect that was primarily genotype-independent, given the reductions in lipids, ratios of lipid/protein (HDL2 and HDL3), Castelli I index, free fatty acids and a higher estimated LDL size; this lipid-lowering effect are in line with previous studies29,30.
TT and CC genotypes were not different regarding the chemical composition of HDL2 and HDL3; all changes in the composition were determined by atorvastatin. In HDL2 we observed a decrease in all lipids, with a significant increase in proteins. This finding suggests that HDL2 became more delipidated, with no change in particle number. Furthermore, HDL3 had an enrichment of lipids and proteins - with a consequent decrease in the lipid/protein ratio, which points to an increase in the number of HDL3 particles.
This set of changes suggest an increased activity of hepatic lipase, in contrast to studies which show that atorvastatin would be responsible for the decrease in its activity31. On the other hand, the increase in HDL3 particles suggests that atorvastatin promoted an exchange between the neutral lipids and lipoproteins and HDL2 particles became triglyceride enriched, an ideal substrate for PLTP to form HDL3 particles32,33.
In our study no interactions between hsCRP and atorvastatin were observed, despite a 40% of reduction after the treatment. Gensini et al34 demonstrated that treatment with atorvastatin, particularly at a dose of 80 mg/day, effectively reduces the plasma levels of hsCRP, despite the presence of metabolic syndrome or diabetes mellitus.
We observed that NO metabolites decreased significantly after atorvastatin treatment; the same results were seen in patients with peripheral arterial disease35. However, most studies show an increase or maintenance of these levels36.
Borderline interactions between atorvastatin and CC genotype were seen for CETP and Lp(a). Lp(a), although it was not different between groups, had a tendency to increase in CC after atorvastatin. Furthermore, previous studies showed that the presence of polymorphism T-786C in diabetic patients is an independent risk factor for the impairment of endothelium-dependent vasodilatation37.
Interestingly, CC volunteers show significant higher CETP activity, which decreased, although not significantly, after statin use. On the other hand, after statins, TT group show a borderline increase. The increased activity of CETP reduces HDL and increases its catabolism by hepatic lipase38. Thus, the use of atorvastatin "corrected" the initial condition of CETP in the CC group, as atorvastatin was able to reduce its activity15,31. A study conducted in the Chinese population showed that the presence of T-786C and Taq1B (a polymorphism of CETP gene) is responsible for an increased predisposition to non-valvular atrial fibrillation39, contributing to the possibility that there are more complex relationships between these two variables in addition to the increased activity of CETP.
In the CC genotype a significant reduction of free fatty acids after the use of atorvastatin was shown, but there were no changes in the TT genotype. This suggests that the polymorphism may have a beneficial effect through lower mobilization of free fatty acids from adipose tissue to plasma and liver, facilitating the suppressive effect of statins on plasma free fatty acids. The involved mechanisms are not fully elucidated40.
We would like to comment some points in this study that could be considered for further study, such as the fact that we have not assessed the effects of other doses of atorvastatin and/or other statins. Moreover, the study was conducted only in healthy Caucasian men, and in a relatively small number of subjects, a fact that may have limited the power to detect differences between the studied groups.
These results together suggest that statin treatment may be relevant for primary prevention of atherosclerosis in patients with the eNOS gene T-786C polymorphism from the point of view of the lipid metabolism repercussions.
We would like to thank FAPESP (Foundation for Research Support of the State of São Paulo) and CNPq (National Council for Scientific and Technological Development) for the financial support to this work.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was funded by FAPESP and CNPq.
This article is part of the thesis of master submitted by Vanessa Helena de Souza Zago, from Faculdade de Ciências Médicas – Universidade Estadual de Campinas.